Nature︱重磅！ 阿尔茨海默症和正常神经元中体细胞APP基因的重组研究

Authorship (Chinese)︱LTNeurosci

Responding Editor︱LTNeurosci

Intellectual activities such as playing chess or regular social interaction have been linked to a reduced risk of AD in epidemiological studies, although no causal relationship has been found. Credit: Wikipedia

神经元的形态和功能的多样性是人脑所固有的，但其基本原理在很大程度上仍是不清楚的。对此，早期有学者推测：在此多样性形成中有基因重组的参与【1】。这一机制类似于在免疫系统中，B细胞产生多种不同的抗体，以对抗病原【2】。但是，这种推测在大脑中依旧没有得到证实【3】。

基因突变不仅发生在受精卵中，进而影响到生物体的所有细胞；同时，基因突变也发生于生物体细胞的某一亚单位中，后者则被称为嵌合现象（mosaicism）【4-5】。嵌合现象在大脑中很普遍，且与多种神经系统疾病有关，包括散发性阿尔茨海默症(AD)，而散发性AD又最为常见【4-6】。

基因组嵌合现象（genomic mosaicism）最初在神经祖细胞和神经元中被鉴定为是非整倍体和DNA含量的变异，两者都呈现出大量的拷贝数变异【7-8】。随后又鉴定出随机分布、较少百万碱基（megabase-scale）的拷贝数变异、LINE1重复元件（注：LINE1是一种广泛分布于人基因组中的重复序列核元件，其数量大约有50万个）、以及单核苷酸变异【5, 9】。

由此看来，基因组嵌合可以影响细胞存活和基因转录，但是，有关特定基因的体细胞基因重组的研究尚未见报道。

APP是神经元重组的一个候选基因，它能够表现出正常人脑中的嵌合拷贝数变异。已有研究发现，这种嵌合拷贝数变异会在散发性AD中增加【10】。

APP是淀粉样蛋白假说的核心：淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein，APP）由分泌酶裂解形成有毒的β-淀粉样蛋白（Aβ）肽和斑块，进而引起AD【11】。

组成型APP（constitutive APP）突变及其复制会导致家族性AD的罕见类型、以及唐氏综合症中的AD神经病理学，这说明当组成型APP突变及其复制以嵌合体的形成出现在散发性AD中时则会表现致病作用【12-13】。

在之前的研究中，已经鉴定出嵌合型、神经元APP拷贝数变异，这类拷贝数变异表现出异构性信号（heterogeneous signals），而基因重组可以解释这种现象【10】。

然而，当用低深度、短读单细胞测序（能够探测拷贝数变异）技术对APP基因位点（约0.3Mb）进行检测时，结果却显示为阴性，其原因是分辨率局限性（resolution limitations）致使其复杂化【6, 14】。

但是，总之，这种嵌合现象背后的特定基因组的改变仍未得到解决。

在最近一项研究中，来自（美国）桑福德-伯纳姆医学发现研究所（Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute）与（美国）加州大学医学院的合作团队开发了9种针对于小细胞群体中的APP替代策略，用来描述AD中APP基因重组现象(Extended Data Table 1)【15】。

Extended Data Table 1  Nine distinct experimental approaches supporting APP recombination

最终，研究者们成功揭示出一种散发性AD患者的大脑中APP嵌合体增加的新机制，这将有助于我们对神经变性根源的重新认识。该项成果于2018年11月21以Somatic APP gene recombination in Alzheimer’s disease and normal neurons为题发表在Nature（IF=41.577）上【15】。同期，Guoliang Chai（美国加州大学圣地亚哥分校霍华德休斯医学院）及Joseph G. Gleeso（同上）对此项工作做了重要点评【16】。

文章中，首先，Ming-Hsiang lee等人分析了神经元信使RNA中的APP突变体。他们鉴定出许多APP mRNA变体，这些突变体缺乏内含子，只剩下编码蛋白质的外显子。然而，突变体不但序列要更短些，而且包含单核苷酸突变、插入和缺失的外显子、以及能促使新外显子形成的更大缺失片段。并且，其中一些突变与家族性AD有关 (Fig.1-2)。

Fig. 1 Identification of novel APP RNA variants from small populations of neurons.

此外，研究人员在研究神经元的基因组DNA时发现了相同的短变异体，这表明APP-突变mRNAs（APP-variant mRNAs）可能是从匹配的基因组DNA序列中被转录出来的，而且这些突变已经永久性地嵌入到了神经元的基因组中。文中研究人员将这些序列命名为基因组互补DNA（genomic complementary DNAs，简称gencDNAs）。为了进一步验证神经元中APP gencDNAs的存在，Ming-Hsiang lee等人使用了两种独立的策略：一种为DNA原位杂交技术(DNA in situ hybridization，DISH)，其能够使得荧光分子与DNA中的gencDNA-特异性外显子-外显子接头（gencDNA-specific exon–exon junctions）相连接；另一种是APP DNA短片段测序（sequencing of short sections of APP DNA）。两种方法都证实了gencDNA变异存在于神经元中 (Fig.2)。

Fig. 2 APP gencDNAs identified by DNA polymerase-dependent and -independent methods.

紧接着，研究者们采用DNA测序技术分析了gencDNA多样性的程度。他们总共从5名散发性AD患者大脑的96424个神经元中，成功鉴定出了6299种不同的APP gencDNA突变体，且数量约为健康者（未患散发性AD）的10倍。与此相一致的是，通过DISH还发现AD神经元中有更多的 gencDNAs (Fig.3)。

Fig. 3 Thousands of unique gencDNAs identified by SMRT sequencing of neurons from non-diseased brains and brains of individuals with sporadic AD.

研究人员又揭示出APP gencDNAs存在于AD小鼠模型（J20 transgenic mice）的神经元中，但极少数存在于非神经元细胞或对照组动物的神经元中。此外，gencDNA变异会随着年龄的增长而不断累积。这些发现与APP gencDNA变异在AD进展中的作用是一致的。事实上，他们发现一些APP mRNA突变体被翻译成对细胞有毒的蛋白质，这进一步证实了APP gencDNAs致病的可能性 (Fig.4-5)。

Fig. 4  Mechanistic studies of gencDNA formation in culture.

Fig. 5  Proof-of-concept correlation between gencDNAs and SAD.

最后，Ming-Hsiang lee等人阐明只要满足如下两个条件，gencDNAs就可以在培养的细胞中生成(Fig.4-5)。首先，细胞DNA必须包含该链的断裂序列，其次，逆转录酶必须是具有活性的（active）。数据表明，gencDNAs来源于经逆转录而来的mRNA中间产物，这些中间产物被整合到基因组中，这个过程可能会被DNA的断裂所加强 (Fig.6)。为了验证这一观点，研究人员在人类大脑样本中检测到了逆转录酶活性(Extended Data Fig.1)。之前的一项研究表明处在发育中的大脑内存在DNA断裂，然而这种现象在其他组织类型中很少被观察到【17】。

Fig. 6  Mosaic incorporation of APP variants into the neuronal genome. 

将gencDNAs整合到基因组中可能与逆转录有一些共同的机制，在此过程中，从转座因子的DNA序列中转录出来的RNA可以重新整合到新基因组中，进而产生嵌合现象，我们对这一机制是不清楚的。这些突变可能源于mRNA的错误拼接，也可能是在gencDNAs的基因组整合过程中产生了突变。

Extended Data Fig. 1  Data from six individual brains for each brain from individuals with or without SAD represented as averages in Fig. 5, and variant cytotoxicity.

然而，总的来说，在此研究中，研究者们揭示了一种令人惊讶的现象：大脑中的体细胞基因重组。这种现象以前只在免疫细胞的抗体生成中被报道过，即通过DNA洗牌机制（DNA-shuffling mechanisms）增加了由特定基因编码的蛋白质的多样性【18】。

Ming-Hsiang lee等人的这项研究成功揭示出AD进展过程中一个先前未被预料到的机制，并拓展了我们对大脑嵌合现象起源的理解。但是，神经元中gencDNAs的积累是AD的病因、还是由AD引起的仍有待于进一步的研究。

补充阅读

通讯作者简介

Jerold Chun, M.D., Ph.D.

Professor:

Degenerative Diseases Program

Senior Vice President:

Neuroscience Drug Discovery, Neuroscience and Aging Research Center, Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute

Email: [e-mail] 

Research focus:

Genomic Mosaicism in the Brain: Genomic mosaicism (GM) is a surprising phenomenon whereby cells from the same brain actually have distinct genomes (different DNA sequences). We continue to define forms of GM, involved cell types, and GM’s impact on normal brain function and disease. Diseases of particular interest include Alzheimer’s disease, Down syndrome, Parkinson’s, and other neurodegenerative diseases as well as neuropsychiatric disorders and substance abuse.

Lysophospholipid Receptor Signaling: Lysophospholipids, such as lysophosphatidic acid (LPA) and sphingosine 1-phosphate (S1P) are small fat molecules that act through G protein-coupled receptors (GPCRs) on the surface of cells. We continue to study fundamental aspects of their signaling properties, and their disease roles in hydrocephalus (water on the brain), neuropsychiatric disorders (schizophrenia, autism), and neurodegenerative disorders (multiple sclerosis, Alzheimer’s disease).

Neuroscience Drug Discovery: From these and other research areas, new therapeutics for diseases of the brain are being pursued, which include identifying new targets, novel biomarkers, and mechanism-of-action studies. This approach successfully aided in the development of the first oral treatment for multiple sclerosis, fingolimod, and related lysophospholipid receptor compounds. Drug discovery efforts include not only small molecules, but also other forms of molecular therapeutics.

文献参考

【1】Dreyer, W. J., Gray, W. R. & Hood, L. The genetic, molecular and cellular basis of antibody formation: some facts and a unifying hypothesis. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 32, 353–367 (1967).

【2】Hozumi, N. & Tonegawa, S. Evidence for somatic rearrangement of immunoglobulin genes coding for variable and constant regions. Proc. Natl Acad. Sci. USA 73, 3628–3632 (1976).

【3】Chun, J. J., Schatz, D. G., Oettinger, M. A., Jaenisch, R. & Baltimore, D. The recombination activating gene-1 (RAG-1) transcript is present in the murine central nervous system. Cell 64, 189–200 (1991).

【4】Biesecker, L. G. & Spinner, N. B. Nature Rev. Genet. 14, 307–320 (2013).

【5】Richardson, S. R., Morell, S. & Faulkner, G. J. Annu. Rev. Genet.48, 1–27 (2014).

【6】Rohrback, S., Siddoway, B., Liu, C. S. & Chun, J. Genomic mosaicism in the developing and adult brain. Dev. Neurobiol. https://doi.org/10.1002/ dneu.22626 (2018).

【7】Rehen, S. K. et al. Chromosomal variation in neurons of the developing and adult mammalian nervous system. Proc. Natl Acad. Sci. USA 98, 13361–13366 (2001).

【8】Westra, J. W. et al. Neuronal DNA content variation (DCV) with regional and individual differences in the human brain. J. Comp. Neurol. 518, 3981–4000(2010).

【9】McConnell, M. J. et al. Intersection of diverse neuronal genomes and neuropsychiatric disease: The Brain Somatic Mosaicism Network. Science 356, eaal1641 (2017).

【10】Bushman, D. M. et al. Genomic mosaicism with increased amyloid precursor protein (APP) gene copy number in single neurons from sporadic Alzheimer’s disease brains. eLife 4, (2015).

【11】Selkoe, D. J. & Hardy, J. The amyloid hypothesis of Alzheimer’s disease at 25 years. EMBO Mol. Med. 8, 595–608 (2016).

【12】Hooli, B. V. et al. Rare autosomal copy number variations in early-onset familial Alzheimer’s disease. Mol. Psychiatry 19, 676–681 (2014).

【13】Wiseman, F. K. et al. A genetic cause of Alzheimer disease: mechanistic insights from Down syndrome. Nat. Rev. Neurosci. 16, 564–574 (2015).

【14】Rohrback, S. et al. Submegabase copy number variations arise during cerebral cortical neurogenesis as revealed by single-cell whole-genome sequencing. https://doi.org/10.1073/pnas.1812702115 Proc. Natl Acad. Sci. USA (2018).

【15】Ming-Hsiang lee, et al. Somatic APP gene recombination in Alzheimer’s disease and normal neurons. Nature https://doi.org/10.1038/s41586-018-0718-6 (2018).

【16】Guoliang Chai, Joseph G. Gleeson. A mosaic mutation mechanism in the brain. Nature. https://doi.org/10.1038/d41586-018-07334-9(2018).

【17】Blaschke, A. J., Staley, K. & Chun, J. Development 122, 1165–1174 (1996).

【18】Tonegawa, S. Nature302, 575–581 (1983).

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