【First-in-class药设系列】创新药物研发中的高通量筛选方法进展

    高通量筛选在新药发现的初期发挥着重要的作用，为苗头化合物的发现提供技术基础。现今常用的一些筛选体系大致可以分为生化筛选体系和细胞筛选体系两大类进行讨论。生化筛选体系包括荧光偏振和各向异性（Fluorescence polarization and anisotropy, FP/FA）、荧光共振能量转移（Fluorescent resonance energy transfer, FRET）、时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET)和荧光寿命分析（Fluorescence lifetime analysis）。基于亲和的筛选方法也隶属于这类，包括核磁共振（NMR）、表面等离子体共振Surface plasmon resonance, SPR）、质谱分析（Mass spectrometry, MS）、热漂移实验（Differential scanning fluorimetry, DSF）。基于细胞的筛选方法包括细胞活力（Cell viability）、报告基因（Reporter gene）、第二信使（Second messenger）、高通量显微镜筛选（High-throughput microscopy assays）和基于CRISPR/Cas9系统的筛选。

    新药开发的过程是漫长、复杂和不确定的，高通量筛选(High-throughput screening，HTS)是小分子药物设计中用于发现起始化合物的策略之一。一般来说，当对靶标研究较少时，HTS是首选。根据与疾病的相关性，综合考虑与其他靶标的联系以及创新性，来进行HTS的靶标或细胞模型的选择。筛选技术的选择是由靶标的可筛选性及其假定的化学易变性决定的。不同的筛选技术适用于不同的靶标，对筛选技术的评述对之后的HTS具有重要的指导作用。

    进行HTS有一定的先决条件，首先是靶标的前期确证，其次是灵敏且稳定的筛选方法，最后是结构丰富的化合物库。在HTS后，还需要对苗头化合物进行进一步的确证。常用的方法是重新购买，确认纯度，测定亲和力和浓度梯度实验，进行多方法的实验检测，再去卷积分析排除假阳性。还可以利用靶标蛋白的同源家族蛋白\突变体等备选进行特异性筛选，多向印证化合物的选择性。

一、生化筛选体系

生化筛选利用纯化的靶标蛋白，在体外测定配体的结合或酶活性的抑制。这些分析通常采用竞争形式进行，即研究中的化合物必须取代已知的配体或底物。通常使用384孔板进行检测，一般采用20-50 μL的检测体积，并使用光学方法读出，如吸光度，荧光，或发光。荧光法由于其更易操作、高灵敏度和灵活性，已经在很大程度上取代了传统的放射性标记配体分析方法。常用的荧光检测方法有以下几种：

1. 总荧光分析（Fluorescence intensity, FLINT）

在固定时间内对孔的荧光值进行积分如100 ms。常用于含染料的底物，在酶催化反应后生成具有荧光的物质，如蛋白酶介导的肽荧光基团的裂解。FLINT会受到许多因素的影响，如被检测物质的自发荧光和淬灭（与被检测物质相互作用而非底物）以及加样误差等。一般来说，用于标记的染料的激发波长越长，从筛选化合物的光谱干扰就越小。

2. 荧光比率法（Ratiometric fluorescence methods）

常见的HTS筛选体系包括荧光偏振（FP）和荧光各向异性（FA）检测。此方法相较FLINT更不易受人为因素的影响，通过测定分子一定时间的旋转变化，表征相互作用对测定分子的影响。在这些技术中，使用偏振光来激发荧光团，并使用平行于和垂直于入射光偏振的偏振器来测量荧光发射。当染料标记的分子随时间翻转时，发射信号会去偏振。与大分子的结合降低了荧光团的迁移率，从而增加了偏振值或各向异性，并允许定量结合。因为不同荧光素的荧光寿命不同，利用此特性可以最大化筛选体系的灵敏度。有机染料如fluorescein和rhodamine荧光寿命约3-4 ns，当它们与约0.5-10 kD的分子结合时，检测灵敏度最高。所以荧光比率法最适合用于分子量差异很大的分子间相互作用的测定。

3. 荧光共振能量转移（FRET）

来自荧光供体的能量通过偶极-偶极相互作用被受体吸收。能量传递的效率取决于供体和受体之间的光谱重叠，它们的距离和相对方向，以及福斯特方程中的其他参数。常见的能量供受体距离是26 nm，适合许多蛋白-蛋白相互作用。

4. 时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）

是由荧光共振能量转移衍生而来的一种筛选方法。具有长寿命荧光(通常为100秒到毫秒)的镧系化合物用作荧光供体，荧光蛋白或有机荧光团(例如，别藻蓝蛋白或Cy5)用作受体。然后对受体的荧光发射进行门控(例如，延迟到50ms)，以便在信号采集时，被测化合物中短寿命有机荧光团的荧光发射已经衰减。典型的商业化合物库里分子荧光寿命在皮秒范围内。此外，350 nm供体激发和670 nm受体发射之间的大斯托克斯位移进一步有助于最小化背景信号。镧系化合物的荧光发射也表现为多个窄波长，这与有机染料的宽波长发射不同，后者允许与荧光受体进行多路复用。

5. 荧光寿命分析（Fluorescence lifetime analysis, FLA）

一种不太常见但有效的检测方法，在高通量筛选中，FLA使用时域数据采集来确定样品中存在的荧光物质的寿命。FLA的理想染料是钌络合物，其荧光寿命约为20 ns。与荧光强度的测量相比，寿命测量对样品中其他材料的颜色(如测试化合物)的敏感性要低得多。此外，在分析数据时，两种生命周期通常都适用，这允许删除寿命较短的组分，类似于TR-FRET实现的效果。

6. Alphascreen

荧光发射的波长比激发光的波长长，与其相反，AlphaScreen是一种非放射性的基于距离的分析方法，使用单线态氧敏化在较短的波长上产生发射，从而避免荧光伪影。待测分子偶联在两种不同的水凝胶包覆微珠上。供体微珠含有光敏剂(酞菁衍生物)，当被680 nm的光刺激时产生单线态氧。如果受体微珠(包含二甲基噻吩衍生物及Eu螯合物)贴近供体微珠，导致化学发光和短的波长的光发射(520-620 nm)。

二、基于亲和力的筛选体系

基于结合的分析直接观察库里化合物与目标蛋白的结合，而不考虑它们对蛋白质功能的影响。上文所述的生物化学方法则是测量酶/受体功能的改变或探针/蛋白质结合的抑制。一般来说，基于结合的测定法使用的生物物理技术比基于竞争的筛选法更耗费材料和时间，因此最常用于小型化合物库。基于结合的方法也被用于具有挑战性的孤儿靶点和药物发现过程的后期阶段，如苗头化合物验证、优化和先导化合物的优化。

1. 基于片段的药物设计(Fragment-based drug design, FBDD)

一种特别适合生物物理方法的应用。FBDD涉及片段的筛选，这些片段是小分子(<280 Da)，与蛋白质形成弱相互作用，典型的解离常数在毫摩尔到微摩尔范围内。FBDD利用小化合物库覆盖更大的化学空间(例如,使用103的片段可能达到105 -106年传统的HTS化合物库的效果)，同时为药物化学提供了一个灵活的起点。片段发现对于靶向蛋白质-蛋白质相互作用和传统化合物库作用有限的难成药靶标特别有帮助。FBDD中最常用的方法是NMR(核磁共振)、表面等离子体共振和X射线晶体学。

2. 核磁共振（NMR）

NMR可用于配体检测和蛋白质检测两种模式。配体检测的核磁共振测量在目标蛋白存在时，配体质子或其他核磁共振活性核的强度或弛豫的变化，通过从蛋白质到配体的磁化转移，称为奥氏核效应。通常使用1H-NMR，使用配体检测模式，对蛋白质没有大小限制，只需要低浓度的蛋白质，也不需要同位素标记。但另一方面，基于配体的NMR可能无法区分特异性和非特异性的结合作用。虽然蛋白质检测核磁共振更费力，但它提供了化合物结合位点的具体信息，特别是当核磁共振峰被分配到特定的蛋白质残基时。因此，在初次筛选后，蛋白质检测NMR通常作为二次检测。蛋白质检测NMR最常用的方法是1H-15N和1H-13C异核单量子关系(HSQC)，它们分别对蛋白质主链或含甲基侧链的化学环境变化非常敏感。最近，反胶束封装已被提出，以扩大核磁共振在FBDD中的检测限度，这可能允许测量离解常数超过200 mM。

3. 表面等离子体共振（SPR）

一种非常灵敏的方法来实时监测两个物种之间的结合，且可进行高通量筛选。SPR测量金/玻璃/溶剂界面的折射率变化，即光在表面等离子体上损失的角度(“SPR dip”)。在典型的SPR实验中，小分子或蛋白质流过靶标或其他结合物质被固定的表面。重要的是，折射率的变化与结合材料的质量成正比；因此，SPR可以测量结合化学计量学和结合动力学。通常，靶蛋白被固定在传感器上，使用赖氨酸的共价连接或通过亲和捕获方法，如多组氨酸标签、生物素或Fc受体。这种形式允许每天测量数百个分子，但这可能受到蛋白质稳定性的限制。或者，微阵列固定化化合物文库提供更高的通量，但需要对文库进行化学修饰以固定化。为了区分特异性和非特异性结合，可以对已知配体进行竞争实验或对蛋白质进行突变验证。虽然SPR非常敏感，但它相对昂贵，需要严格控制缓冲液、温度和悬浮颗粒物。

4. 生物膜层干涉（Biolayer interferometry, BLI）

与SPR原理类似，测量固定蛋白层与内部参考层之间的信号干涉。这种技术更容易使用，但比SPR不敏感，因此通常用于测量蛋白质之间的相互作用，而不是蛋白质与小分子之间的相互作用。

5. 二次谐波产生（Second-harmonic generation, SHG）

另一种基于板的测量亲和力的方法，测量384孔板中固定在脂质双分子层上的染料标记蛋白的内部总反射率的变化。信号的二次谐波分量对二次谐波活性染料(PyMPO衍生物)相对于表面的取向非常敏感(具有亚埃分辨率)，当配体与目标结合并改变其构象时，信号的二次谐波分量会发生变化。因此，SHG能够在化合物库中筛选变构或诱导构象改变的分子。

6. 质谱分析（MS）

广泛用于筛选蛋白质和小分子间的相互作用。一种常见的形式是亲和选择-质谱(AS-MS)，其中蛋白质和化合物池孵育，蛋白质配体配合物从未结合的化合物中迅速分离，结合的配体然后用LC-ESI-MS解离和鉴定。蛋白质配体配合物与未结合配体的分离可以通过多种方法实现，如超滤或分子排阻层析。另外，蛋白质分子加合物也可以在特定的环境下用质谱进行测量，如二硫键结合化合物或共价化合物的筛选。

7. 热漂移实验（DSF）

差示扫描荧光法（DSF）和热漂移实验（Thermal shift assay, TSA）都是指的这一方法，通过检测温度升高时染料的荧光增加，测定蛋白质的去折叠，这种染料与蛋白质的疏水部分有亲和力，当蛋白质展开时，疏水部分暴露出来，荧光增强。与目标物结合的化合物使其稳定并提高熔解温度。

8. DNA编码化合物库（DNA-Encoded Library technology, DEL）

DEL是通过一种均分与合并的方法建立的，化学支架混合在一起，然后分开进入容器为下一轮化学反应。在每个容器中加入不同的化学取代物，然后再次合并和均分，以进行下一个反应。裂解池化学的产物是一种复杂的混合物，它可以包含数百万甚至数十亿种化合物。对于DEL，开始的支架被标记为独特的DNA序列;在每个反应步骤中，添加另一个DNA序列，作为添加的化学取代基的条形码。然后，DNA条形码编码的混合物被应用到含有感兴趣的蛋白质的微珠上。冲洗掉未结合的化合物，洗脱结合的化合物，并进行PCR和二代测序，以确定哪些DNA偶联化合物与蛋白质结合。

9. X射线晶体衍射（X-ray crystallography）

研究小分子/蛋白质复合物的高分辨率方法。虽然X射线晶体学需要最多的蛋白质(毫克)和结晶是耗时的，但它可以极大地促进配体的结构导向设计，以改善亲和力。目前高通量结晶方法已经开发出来，并且衍射也有相应的高通量设施，不过主要依赖于化合物浸泡（Soaking）的方法实现。

三、基于细胞的筛选体系

化学探针和药物先导的发现不仅可以基于与特定靶标的相互作用，也可以基于它们诱导细胞/生物体表型的能力。基于细胞/生物体的筛选通常使用在1）理想的分子靶标是未知的；2）生化方法不能充分重现靶标反应体系；3）理想的表型只存在于细胞背景下，如细胞分化等。功能性结果还可以提供大量的机制信息，如区分完全激动剂，部分激动剂，反向激动剂和变构调节剂。异质性也可以被测量，特别是当细胞可以可视化高内涵成像时。最后，基于细胞的方法还可以报告化合物的膜通透性和细胞毒性，这是基于结构的药物开发失败的主要原因。

    基于细胞的方法可以应用在药物发现的整个进程中：靶标识别和验证、初筛、先导鉴定、先导优化以及安全性和毒性筛选。常用的方法如下，细胞增殖、第二信使、报告基因、蛋白质片段互补、酵母双杂法和基于显微镜的分析。细胞模型的选择是至关重要的。人源建模中，细胞系通常被改造带有报告基因或者其他特征。目前趋势更多的是建立“疾病样”模型，包括原代/患者来源的细胞和涉及3D细胞培养或多细胞种类的复杂培养。人们对使用灌注培养和其他微流体装置来评估化合物对细胞的长期影响也越来越感兴趣。此外，小动物模型，如线虫和斑马鱼越来越多地被用作小分子筛选的高通量模型。

1. 细胞增殖（Cell viability）

细胞增殖常用于鉴定能杀死癌细胞或病原体的化合物，并可检测在肝脏等器官中的潜在安全问题。常用有效的活性测定方法是利用荧光素酶/荧光素在ATP依赖的反应中发光来测定ATP含量。荧光素酶的检测非常敏感(每孔可以检测到少于10个细胞)，可以适用于1536孔板。染料如钌、阿尔玛蓝、双偶氮化合物（MTT、MTS、XTT和WST-1）也可用于增殖测定，这些通常转化产生荧光或者颜色来表明存活或者死亡。细胞活力也可以通过检测培养基中释放的胞内酶（蛋白酶，LDH）或用非膜荧光染料插入DNA（如碘化丙啶）来评估。

2. 报告基因（Reporter gene）

报告基因分析(也称为信号通路分析)，报告蛋白的编码序列是在相关通路的转录控制下引入的。报告基因的表达通过检测发光或荧光，反映启动子激活或抑制的程度。观察到的信号是整个通路的产物，被筛选的化合物可以在任何一点相互作用。常用的报告基因是CAT(氯霉素乙酰转移酶)、GAL(β-半乳糖苷酶）、LAC(β-内酰胺酶)、LUC(荧光素酶)和GFP。报告基因方法的一个缺点是，它们通常需要长时间培养才能转录和翻译，因此增加了间接影响的可能性。最新的发展方法是使用不同的报告基因来同时检测多个通路。

3. 第二信使（Secondary messenger）

第二信使法检测信使分子在通路中的表达或运输，比报告基因法提供更相近的响应。这种检测被广泛用于GPCR靶标。例如，如果靶标激活细胞内Ca2+存储，其活性可以直接使用钙敏感染料(如氟-3，氟-4，基于水母发光蛋白的发光)测定。如果GPCR不能自然地调节细胞内Ca2+水平，它可以被设计成使用混杂或嵌合G蛋白(也被称为通用适配器)刺激Ca2+信号。这些方法的一个特点是其快速的响应时间，这需要在以秒的数量级内整板注入化合物并CCD检测，如FLIPR或FDSS。较慢的读出分析，如arrestin或TANGO，也被开发用于GPCR筛选。荧光测定法已被开发用于测量其他信使，如K+，或其荧光信号随膜电位变化的膜结合染料。

4. 蛋白质片段互补分析和双杂交筛选（Protein-fragment complementation）

蛋白质片段互补分析(PCA，也被称为双分子荧光互补)和双杂交筛选可以检测细胞中蛋白质-蛋白质相互作用的形成/抑制。PCA将单个检测蛋白(荧光素酶，GFP, GAL)分成两部分，融合到感兴趣的蛋白质互作分子上；如果伴侣结合，检测蛋白重新形成，信号可被检测到。在小分子筛选中，不可使用GFP，因为这两个片段不可逆地结合，不能通过小分子的结合而解离。最近一种可逆性荧光互补结构被报道，其通过一种结合小分子染料的蛋白，增强荧光。双杂交(2H)筛选是另一种基于活性转录因子形成的互补方法。在双杂中，DNA结合域与诱饵蛋白结合，而转录激活域与靶蛋白结合。报告基因(如GAL或LAC)插入启动子后，如果靶蛋白与诱饵结合，激活域与报告基因相连，激活报告基因并能被检测到。在存在抑制蛋白质互作的化合物时，激活被阻止。

5. 高内涵显微成像（High-content imaging）

HCS仪器自动收集在多孔板中生长的细胞的光学或荧光图像;然后，这些图像会自动分析所选择的任何可测量特征。典型的仪器可以读四色荧光2- 40倍的目标。宽视野和共焦工具都是可用的，顶级设备可以读取到63倍的水浸目标。在获得图像后，使用定量的图像分析工具提取特征，并将其转换为数字数据。可测量的特征非常多。例如，从单一的DNA结合染料，可以测量核的大小、形状、强度和纹理(像素到像素的可变性)。

三、靶标识别

在通过基于表型的方法鉴定出有希望的先导化合物系列之后，需要鉴定出相应的靶标。这些技术通常用于开发中的临床前分子，但同样可以应用于已批准的目标未知的药物。识别一种化合物的靶标将大大有助于理解其生理相关性，优化其亲和力，确定脱靶效应，以及获得新药物的监管批准。靶标去卷积方法可分为三大类:化学蛋白质组学、化学遗传学和生物信息学比较法。一般来说，这些方法的结果是通过敏感的体外试验验证的，如SPR。

1. 化学蛋白质组学（Chemical proteomics）

基于亲和的方法是最古老和最直接的方法来阐明小分子靶标。在一种流行的形式中，配体被固定在载体上(如磁珠)，与细胞裂解液孵育，使其与蛋白质组相互作用。结合蛋白被洗脱，用胰蛋白酶消化成多肽，用液相色谱分离，然后用质谱和生物信息分析(鸟枪法蛋白质组学)鉴定。定量质谱蛋白质组学允许比较由生物活性配体拉下的蛋白量与那些结合到非活性的配体类似物(阴性对照)，从而区分非特异性结合。其他以亲和力为基础的形式也有报道，其中一些涉及到蛋白阵列的标记，而不是配体，使用凝胶电泳进行蛋白分离，或对配体进行化学修饰，使其能以共价方式附着在细胞中的目标物上。

    基于亲和分离的一个缺点是固定化和衍生化可以影响观察到的结合亲和。标记也需要化学合成的专业知识，也可能不兼容所有的配体。在基于活性的蛋白质分析(ABPP)中，配体与探针竞争与特定靶标类的成员结合。细胞热漂移试验(CETSA)由热漂移试验衍生来的，其中化合物被添加到细胞中。细胞或裂解物被加热到不同的温度，并监测蛋白质的变性。配体的结合稳定靶标蛋白，使它们在较高的温度下才熔解。CETSA可通过凝胶电泳或质谱检测。

2. 生物信息学分析（In silico comparative profiling）

可以将所研究的分子对细胞表达谱或表型的影响与已知生物活性小分子参考数据库中的分子进行比较，从而推断出实验分子的靶标和作用机制。可用于比较的表型谱包括遗传、转录组、蛋白质组和高内涵显微镜数据。

3. 化学遗传学（Chemical genetics）

化学遗传方法确定基因表达水平如何改变化学制剂的效果。特别是，可以在全基因组范围内增加或减少基因产物的表达，并监测配体诱导的表型变化。与其他靶标去卷积策略相比，这提供了独特的优势，如不局限于可溶性蛋白，并允许区分直接和间接结合物，这为药物的作用机制提供了更深入的了解。最初，化学遗传学研究在有限数量的唯一可行的生物模型像酵母利用包含基因片段的多拷贝质粒，或通过比较减少基因的拷贝数的影响。如今，化学遗传技术包括RNA干扰(RNAi)、条形码开放阅读框(ORF)库和CRISPR筛选，这些技术能够以系统和有效的方式干扰哺乳动物细胞中的所有基因。基于CRISPR和RNAi的方法都适用于汇集筛选，因为这两种系统(sgRNA或shRNA)的表达结构都有DNA副本整合到基因组中，它们本身作为分子条形码，为目标基因编码。

四、未来与展望

进行药物开发目前有两条热门的途径，其一是根据基础研究选择具有重大意义的疾病靶标，特异性设计HTS的筛选方法，选择合适的靶向药物库进行筛选，利用多重方法进行苗头化合物和先导化合物的鉴定与验证。其二是根据疾病特征性选择合适的表型模型，根据表型的特征性，选择合适的表型筛选体系进行表型筛选实验，获得先导化合物后进行靶标去卷积鉴定和验证作用靶标，可再结合基于结构的药物筛选进行进一轮的结构优化提升药效，综合各药物设计策略的长处，开发原创新型药物。

参考文献

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