扩增子分析基本流程和结果解读
扩增子分析是目前宏基因组研究中最常用的技术，由于微生物组受环境影响大，实验间重复较差，更需要更多的实验重复和分析技术来保证结果的准确性、可重复性。
本系统文章即有详细的扩增子分析流程代码，又有本人对使用参数、备选参数意义的解读，可以让大部分人零基础学习并理解数据分析过程，并可亲自实践在自己的课题上，获得更好、更合理的实验结果。
本文采用目前最主流的扩增子测序数据类型HiSeq2500 PE250类型数据为例，结合目前主流方法QIIME+USearch优点组合定制的分析流程。本课程中所需的测序数据、实验设计和课程分析生成的中间文件，均可后台回复“扩增子”获取。
学习前必读
测序数据：百度云原始链接的数据是随时更新的，请尽量使用下载链接里的文件。转存入自己的帐号内文件将不再更新，无法修正读者指出的错误反馈。
本课程代码的运行，至少需要Linux平台+安装QIIME1.9.1，我之前发布过QIIME1.9.1安装的三种方法如下：
虚拟机安装：适合在Windows上学习，但分析效率低。
Docker安装：Linux上最简单的安装方法，需要管理员帮忙并给你开通部分权限。
管理员直接安装：直接安装QIIME1.9.1相关的上百个程序和包，不同环境依赖关系不同，需要极丰富经验，建议管理员安装。
以上三种方法均可点击链接有详细教程，总有一款适合你。
本套流程主要依赖QIIME1.9.1。之前发布的QIIME2不是QIIME的升级版，而是完全独立的分析系统，两者没有任何通用的地方，而且现在还不成熟，明年才有稳定版。请读者千万别混淆。不要再犯用QIIME2系统运行本教程扩增子分析流程解读，无法找到相关程序的错误。
其它不在QIIME流程中的相关软件，我在教程里提供简单的安装方法，使用前仔细阅读教程操作即可。
扩增子分析流程目录
先看一下扩增子分析的整体流程，从下向上逐层分析。
扩增子分析流程，主要包手下面7部分，共21小节。
1 质控,实验设计,双端序列合并
查看原始数据的质量，编写合格的实验设计用于分析，双端序列合并为单端的扩增子序列；2 提取barcode,质控及样品拆分,切除扩增引物
将Barcode序列从序列中拆除，筛选高质量的测序结果并标记文库中每条序列中的样品来源，最后切除扩增时使用的引物；3 格式转换,去冗余,聚类
转换QIIME生成fasta格式为Usearch要求格式；使用Usearch对序列去冗余并筛选高丰度，极大降低下游计算量和去除噪音；最后使用用Usearch聚类生成OTU，默认会组内自动去除大量嵌合体；4 去嵌合体,非细菌序列,生成代表性序列和OTU表
本讲详细讲了嵌合体的概念，并使用参考数据库去除嵌合体；学习基于参数数据库筛选细菌序列，这些都是可选的操作，根据实际情况决定是否需要，最终生成高质量的OTU序列作为参考序列；5 物种注释,OTU表操作
这部分采于不同数据库进行细菌或真菌注释；同时根据实际情况，对OTU表进一步按样品、丰度、物种等条件筛选；6 进化树,Alpha,Beta多样性
将OTU多序列比对生成进化树，为依赖进化关系的计算方法提供输入文件；再进行多种Alpha和Beta多样性的计算；7 物种分类统计,筛选进化树和其它
对物种进行分类统计,筛选高丰度结果用于进化树展示，和其它用于R统计分析的结果生成。
写在后面
以上流程，是本人基于多篇高水平文章的解读、同类流程分析流程帮助的阅读和自己理解的产物，不足之处，还请大家多留言讨论或指正。
具体的分析步骤的使用，最重要的是相关项目经验，其次是对课题科学问题的深入理解。自己能想清楚，自然知道如何分析更合理。
大家不要迷信流程一次可以分析出想要的结果，好的结果一般都是经过不断思考，不断优化和改进分析参数和方法得出的。发表前修改流程重新计算30次不算多。具体可看3分和30分文章差距在哪里？。
这部分大家学会了，可以基于以上流程生成的文本信息。采用R语言进一步统计分析，并绘图各种出版级的图片。我将会从下周起开始发布，第一季扩增子绘图有8种常用图型的绘图，及相关的统计方法，与扩增子图表解读的顺序相对应哦！
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我们与2018年3月10-18日在北京鼓楼举办的《扩增子分析专题培训》，课程基于Usearch和Vsearch，多年经验丰富的分析人员总结的，比QIIME (仅仅只是个框架，依赖近200多个软件) 更好用，更方便的系统，而且紧跟分析方法最前沿。
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