跨物种单细胞分析发现胰腺导管癌中一类有免疫原性的抗原呈递成纤维细胞
作者：Swift 清华大学y医学院基础医学系
校对：张虎 协和医院
摘要：
Cancer-associated fibroblasts (CAF) are major players in the progression and drug resistance of pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC). CAFs constitute a diverse cell population consisting of several recently described subtypes, although the extent of CAF heterogeneity has remained undefined. Here we use single-cell RNA sequencing to thoroughly characterize the neoplastic and tumor microenvironment content of human and mouse PDAC tumors. We corroborate the presence of myofibroblastic CAFs and inflammatory CAFs and define their unique gene signatures in vivo. Moreover, we describe a new population of CAFs that express MHC class II and CD74, but do not express classic costimulatory molecules. We term this cell population “antigen-presenting CAFs” and find that they activate CD4+T cells in an antigen-specific fashion in a model system, confirming their putative immune-modulatory capacity. Our cross-species analysis paves the way for investigating distinct functions of CAF subtypes in PDAC immunity and progression.
研究背景：
肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)在癌症的病程发展以及耐药性中起到了重要作用并且CAF主要通过分泌大量生长因子和改变基质结构达到促进肿瘤生长的目的。虽然CAFs的异质性程度仍不明确，但CAFs中的细胞类型的多样性也被逐渐揭示。如在2018年发表于 Nature Communication 的 Spatially and functionally distinct subclasses of breast cancer-associated fibroblasts revealed by single cell RNA sequencing，发现CAF的亚型与临床预后有关，与TCGA数据结合分析发现可以通过对亚型的分析对肿瘤新靶标提供参考。在前期发表与 Cell的 Stromal Microenvironment Shapes the Intratumoral Architecture of Pancreatic Cancer发现在CAF分泌的转化生长因子b（TGF-β）驱动PDAC细胞系中的DP表型；
本文对于来自人和小鼠模型的PDAC样本，作者利用单细胞RNA测序技术对肿瘤及肿瘤内环境进行了分析，证实了肌成纤维性以及具有免疫原性的CAFs的存在，并在体内实验中确定了它们的特征性基因。作者发现了一群表达MHC-II类分子以及CD74，却不表达典型协同刺激分子的新型CAFs，将其命名为抗原呈递型CAFs（apCAFs），并发现这类细胞以抗原特异性的方式激活CD4+ T细胞，证明了它们具有免疫原性。
研究方案
Sample：6个PDAC病人以及2个病人对应的癌旁样本;KPC小鼠模型
单细胞建库：10X Genomics platform （3‘ end）
测序数据分析介绍：
工具：Cell Ranger pipeline (v1.3, 10X Genomics)
参考基因组：
(1)人：hg19 reference (v1.2.0, 10X Genomics)
(2)小鼠：mm10 reference (v1.2.0, 10X Genomics)
作者用Cell Ranger将不同样本合到一起，用Barnes Hut approximate t-SNE(BH t-SNE)方法做降维，再利用DBSCAN进行聚类，在后续进行调控网络分析时用到了ARACNe和VIPER。
在用GSEA进行基因富集分析时，作者使用了的数据库是Molecular Signatures Database v6.1。
图A展示了获取单细胞的流程。作者从人和小鼠上取下的PDAC样本中分离单细胞，利用DAPI染色以及流式分选，将细胞分为包含除成纤维细胞外的所有类型细胞和成纤维细胞两部分。这两部分细胞都分别被用于后续的建库测序实验中。图B是利用t-SNE方法对所有类型细胞进行测序得到的分群图，展示了病人PDAC组织内细胞组成的复杂性。图C展示了图B中各群细胞的特征性基因。将图B中2，8，15三群导管细胞取出来单独分析，鉴定出四种不同亚型的导管细胞 (图D)。图E展示了不同亚型的导管细胞的来源，其中三种亚型的导管细胞的来源包括肿瘤组织和癌旁组织，但第二种亚型（lipid processing）的导管细胞只来源于一个病人的癌旁组织。通过与以往发表的PDAC组织导管细胞的标志性基因进行比较，亚型1和4被鉴定为经典的PDAC组织内导管细胞。从图F中可以看到，亚型4在CRISP3、TCN1、MMP1、SINK1、LAGLS2等基因上与亚型1有明显区别，亚型3相对表达更多与分泌功能以及腺泡蛋白相关的基因，因此被定义为分泌型(secrectory)；来源于癌旁正常组织的亚型2导管细胞表达了与脂代谢加工相关的基因（例如APOA1,FABP1,ADIRF）。图G展示了肿瘤来源的亚型1，3，4三群导管细胞相对于来自癌旁正常组织的亚型2导管细胞高表的基因所富集的通路，能够看到在1，3，4三种亚型的导管细胞中均富集到了PDAC相关的KRAD,p53以及缺氧等通路，与这些细胞来源于肿瘤组织相对应。此外，IFNγ,TNFα,IL2/STAT5等炎症相关通路在这三类亚型的导管细胞中均有富集，可能反映出PDAC具有炎症的特征。
为了确定病人PDAC组织中髓系和淋巴系免疫细胞的亚群状态，作者将前面鉴定出来的两类主要免疫细胞（髓系细胞和T&NK细胞）单独取出来，并按肿瘤和癌旁正常组织两种不同来源分别进行分析。图A显示肿瘤来源的髓系细胞能够被分为6个亚群，癌旁正常组织来源的髓系细胞能够被分为4个亚群，这几个亚群包括大量单核细胞和巨噬细胞(>96%)以及少量的树突细胞(<4%) (图B)。相较于癌旁正常组织，肿瘤组织存在一群高表SPP1,LY6E,MARCO等基因的替代性活化的巨噬细胞(subcluster 4) (图C)。图D显示肿瘤来源的单核细胞和巨噬细胞亚群也表达S100A8,S100A9,G0S2等中性粒细胞的标志性基因，说明肿瘤来源的髓系细胞具有高异质性。（注意：中性粒细胞含量较少且寿命较短，单细胞测序捕捉到中性粒细胞的机会很低，因此如果看到中性粒细胞marker和其他细胞marker共表达时，通常为其他细胞类型。）类似的，相较于癌旁组织，肿瘤来源的T&NK细胞中贡献了大量CD4+ T细胞以及调节性T细胞(Treg) (图EF)。在肿瘤来源的CD8+ T细胞中存在一些高表达IFNG的细胞，但这些细胞也同时表达了LAG3和EOMES （图GH），证明肿瘤来源的T细胞已经由最先的激活状态转为衰竭状态。相较于走向衰竭的T细胞，肿瘤来源的NK细胞保持着激活状态。作者还找到了一群具有NK细胞特性的T细胞，将其定义为NKT细胞。这部分的工作展示了病人PDAC肿瘤微环境的免疫抑制状态。（注意：虽然在肿瘤细胞中CD4+T细胞的含量较高，但同时要发现在该类T细胞中的免疫抑制性占据主导地位，千万不要看到T含量高就觉得是免疫活化的）
作者通过流式分选对编号为hT137病人的单细胞做了成纤维细胞的富集，将这些细胞和之前鉴定的肿瘤来源成纤维细胞的数据合在一起进行分析，共962个成纤维细胞，被分为iCAFs和myCAFs两群（图AB）。iCAFs高表IL6,IL8,CXCL1,CXCL2等基因，myCAFs高表ACTA2基因 （图DE）。此外，HAS1和HAS2在iCAFs中特异性表达。首先采用ARACNe （Algorithm for the Reconstruction of Accurate Cellular Networks）推测与iCAFs和myCAFs相关的转录因子和信号分子的调节蛋白。然后采用 采用VIPER （Virtual Inference of Protein-activity by Enriched Regulon analysis algorithm）计算通路调节蛋白的活性。VIPER算法使用被靶基因的表达做为调节蛋白的活性指示。图F用网络展示iCAFs（红色）和myCAFs（蓝色）中差异激活的蛋白。通过对两种亚型的CAFs的基因进行GSEA分析，发现myCAFs中显著上调了与平滑肌收缩、胶原形成等通路相关的基因的表达，iCAFs中上调了IFNγ、补体等炎症相关通路的基因的表达，这与之前作者在小鼠模型的CAFs研究得到的结论一致 （图GHI）。作者后续对两类不同CAFs相关的转录因子进行了分析，多方面证明了病人PDAC肿瘤组织中存在两种功能相异的CAFs。
作者对KPC小鼠模型来源的4份PDAC样本的所有细胞做了单细胞RNA测序，分析结果显示小鼠PDAC组织与人PDAC组织类似。对富集后的KPC小鼠PDAC成纤维细胞进行分析，发现其中包含了许多EPCAM阴性的导管细胞和三类成纤维细胞（注意：我们在进行negative selection时不能够认为剩下的一定是同一大类细胞，最起码必须保证该大类细胞要表达同一种pan-marker基因），将主要的两类成纤维细胞取出来分析，发现这些成纤维细胞可以被分为三个亚群，其中两群分别类似于人PDAC组织里的myCAFs和iCAFs，还有一群成纤维细胞表达H2-Aa,H2-Ab1等MHC-II家族相关的基因，这群细胞被定义为抗原呈递性CAFs(apCAFs)。这群apCAFs表达了成纤维细胞典型的标志基因(COL1A1,COL4A1,DCN等)，而抗原呈递、MTORC1通路相关的基因在这群apCAFs中表达上调，VIPER分析的结果也显示在apCAFs中被显著激活的是MHC-II家族的基因以及CD74，说明这群细胞确实是具有抗原呈递特性的CAFs.
作者现在从实验的角度来证明KPC小鼠的PDAC组织里确实存在一群抗原呈递性的成纤维细胞。RNA原位杂交实验显示抗原呈递细胞的标志基因H2-Ab1与成纤维细胞的泛标志基因COL1A1存在共表的情况，与数据分析的结果一致 (图A)。基于验证了PDPN这一表面蛋白能够作为成纤维细胞的一个泛基因标志之后，免疫组化实验的结果也显示存在一些共同表达PDPN和CD74的基质细胞，再次佐证了KPC小鼠肿瘤组织中存在抗原呈递性成纤维细胞 (图B)。此外，作者确定了三种亚型成纤维细胞各自的标志性基因，并通过流式分选得到了这三种不同亚型的成纤维细胞 (图CDEF)。
确定KPC小鼠肿瘤中存在apCAFs后，作者尝试在病人PDAC肿瘤组织来源的成纤维细胞中找到这群抗原呈递型成纤维细胞。作者在病人PDAC肿瘤组织来源的成纤维细胞中找到了共表达HLA-DRA和CD74的细胞，证明病人肿瘤组织的成纤维细胞也可能发挥MHC-II家族蛋白的功能 (图ABC)。成像质谱流式结果也佐证了病人肿瘤组织中apCAFs的存在 (图D)。
基于作者之前的研究发现（在类器官培养条件下能够存在的iCAFs在二维培养模式下会转化成myCAFs），作者试图研究apCAFs是否具有内在的可塑性。结果表明从KPC小鼠肿瘤组织经流式分选得到的apCAFs在二维培养模式下不再表达MHC-II家族相关的基因，上调了myCAFs的标志基因的表达，说明apCAFs具有动态变化的特征，也可能需要一定的环境才能存在。作者将KPC小鼠的肿瘤类器官原位移植到具有MHCII-EGFP报告系统的小鼠胰腺上成瘤，再进行流式分选，得到三种CAFs和专门的抗原呈递细胞APCs。为了研究这些CAFs是否具有抗原呈递的功能，作者使用了OTII小鼠模型(小鼠的CD4+T细胞会被APCs呈递的OVA激活)。APCs以及三类CAFs都分别用OVA肽进行了孵育，再与OTII小鼠来源的CD4+T细胞共同培养17h，结果表明只有apCAFs能够像APCs一样在与OVA共孵育后能激活CD4+T细胞。APCs会表达共刺激分子，apCAFs在表达MHC-II家族基因之外也表达CD40,CD86,CD80等共刺激分子。此外，相较于CD45阳性的细胞，三类CAFs都有较低的共刺激分子的表达，apCAFs在表达共刺激分子的水平上与另外两种CAFs差异，这说明PDAC肿瘤组织的apCAFs可能与一般的APCs发挥着不同的功能。（注意：作者在discussion中提出了自己的假设：认为在共表达刺激分子表达水平较低的情况下，apCAFs表达的MHCII起到了诱导受体的作用，从而导致CD4+T细胞失活或者转化为Tregs细胞，使肿瘤处于免疫抑制的状态）
单细胞文章点评
该篇文章与其他研究PDAC间质细胞的单细胞文章一样，同样应用“negative selection”,可见利用间质细胞的蛋白marker抗体依然不能很好的对间质细胞进行分选；
肿瘤细胞的免疫抑制状态其实是一个很solid的事实，于是作者利用这些immune inhibitory marker对整个的免疫系统进行分析，验证已有的现实；其实如果就单从数据角度分析出免疫抑制的结论其实个人认为是不太可能的；
作者分出了几种较为少见的细胞，如表达脂质代谢基因的成纤维细胞，共表达NK maker和CD3D的NKT细胞，对后续他人进行细胞分类时可以提供借鉴；
19年出了好几篇关于PDAC研究的单细胞文章。这篇文章有病人样本数据以及癌旁数据，还有KPC小鼠模型的数据，在人和小鼠两个物种的水平上说明了PDAC肿瘤组织内成纤维细胞的异质性。文章重点在分析成纤维细胞，中间也分析了免疫细胞的异质性，把病人的肿瘤组织和癌旁组织进行比较，说明肿瘤中有CD8+T细胞的积累。在小鼠PDAC肿瘤中鉴定出apCAFs这类新CAFs后，作者用了离体培养以及OTII小鼠来对这类细胞进行研究，揭示了这类细胞的可塑性和呈递抗原的作用，也倒回去看了看人的PDAC组织里是否存在这样的apCAFs。文中还用了VIPER的方法，个人觉得是利用单细胞测序技术研究肿瘤基质细胞的一篇很值得学习的文章了。
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参考文献
Elyada, E., et al. (2019).“Cross-species single-cell analysis of pancreatic ductal adenocarcinoma reveals antigen-presenting cancer-associated fibroblasts.”
原文链接：http://cancerdiscovery.aacrjournals.org/content/early/2019/06/11/2159-8290.CD-19-0094
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