Nature综述：基因编辑疗法，风头正盛

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5月15日，Nature Reviews Drug Discovery上发表了一篇题为“Gene-editing pipeline takes off”的文章。作者在文中对基因编辑疗法的研发管线进行了盘点和分析。放眼全球，包括CRISPR–Cas9、锌指核酸酶（ZFNs）和转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）在内的基因组编辑技术相关的临床试验，正在推动包括眼疾、肿瘤在内的多个治疗领域的发展。

仅在过去的一年半中，至少有11个基因编辑研发项目在美国和欧盟进入临床开发阶段，其中有6个使用的是基于CRISPR–Cas的编辑工具。

“现在是振奋人心的时刻。”CRISPR–Cas技术的先驱之一、加州大学伯克利分校的Jennifer Doudna教授说。在想象这种新兴技术如何改变疾病治疗多年后，关键的临床研究数据终于即将出炉。

虽然迄今为止大多数基因编辑疗法专注于单基因罕见病和肿瘤免疫治疗方面的应用，但研究者们已开始拓展更广泛的应用领域。

“与其它新技术一样，药物开发人员首先会将CRISPR技术应用于没有其他治疗选择的罕见或极其严重的疾病上。首批研究的结果对于是否该技术可被更广泛地应用具有很大的影响。”Doudna教授解释说。

当然，其他基因编辑技术也不容忽视（图1）。基于锌指核酸酶（ZFNs）、转录激活子样效应因子核酸酶（TALENs）和大范围核酸酶（meganucleases）的研发也都取得了进展。

图1 部分基因编辑疗法临床试验启动时间线。a | 锌指蛋白。B | 转录激活子样效应核酸酶（TALEN）。c | 大范围核酸酶。CAR，嵌合抗原受体；HSPC，造血干细胞和祖细胞。（图片来源：Nature Reviews Drug Discovery）

Bluebird bio和Spark Therapeutics等基因治疗领域的领跑者一直在为这一领域的发展奠定重要基础，它们探索递送载体，确立适应证或作用目标。肿瘤免疫细胞疗法的开拓者（如诺华、Kite Pharma）以及寡核苷酸领域的先驱企业（如Ionis Pharmaceuticals和Alnylam Pharmaceuticals）也推动着基因编辑疗法的发展。

CRISPR碱基编辑公司Beam Therapeutics的CEO John Evans认为，整个基因编辑领域正大步向前，未来将会全面加速发展。

体外基因编辑

体外基因编辑是将从患者体内收集的细胞编辑后作为治疗药物再重新注入患者体内，对于探索基因编辑的先头部队来说，这是风险相对较低的起点。

首先，在实验室环境中将基因编辑系统引入细胞要比使基因编辑系统直接进入体内的细胞更容易。因为体外基因编辑可使用电穿孔技术使基因编辑工具跨越细胞膜进入特定的细胞类型，而相对的体内基因编辑则需要筛选和优化能够递送基因编辑系统的载体。

体外编辑也具有安全益处。一方面，体外基因编辑疗法发生脱靶和脱组织编辑的风险较低（可在体外通过检测去除发生脱靶效应的细胞）。当用于体外编辑自体细胞时，基因编辑系统也不太可能会触发免疫反应。此外，研究人员还可以对编辑效率进行量化，并仔细控制剂量，然后再将细胞重新回输到患者体内。

血红蛋白病 

镰状细胞病和β-地中海贫血都是遗传性红细胞疾病，由血红蛋白（负责在体内运输氧气）功能失调或水平不足引起。所有首批体外基因编辑研发项目都聚焦这两种疾病（表1）。

来源：Nature Reviews Drug Discovery

然而，基因编辑技术的首批应用并不是为了直接纠正导致这些疾病的突变，相反，是为了调节胎儿血红蛋白的代偿性表达。胎儿血红蛋白通常仅在出生后2到4个月内表达，但其在成年后的特殊表达能够可以发挥对抗镰状细胞疾病和β-地中海贫血的保护作用。

Sangamo Therapeutics是基因疗法领域的领导者，像参与体外基因编辑疗法角逐的大多数企业一样，其开发的ST-400和BIVV003通过编辑BCL11A来增强胎儿血红蛋白。BCL11A编码通常会关闭胎儿血红蛋白的表达的锌指转录因子。BCL11A的突变体可以提高胎儿血红蛋白水平。

Sangamo于2018年5月开始以上药物的临床试验，根据Clinical Trials.gov，试验的初步完成时间预计在今年晚些时候。

此外，CRISPR Therapeutics和Vertex Pharmaceuticals基于CRISPR–Cas的候选药物CTX001于2019年2月进入临床研究，用于治疗同类疾病。去年两家公司报告了来自2例患者的初步安全性和有效性数据，并宣布将在2021年初完成试验。

不过，血红蛋白病（haemoglobinopathy）领域的竞争可能会很激烈。除了最近用于镰状细胞病的小分子和抗体疗法取得大量成功外，Bluebird bio的一次性体外基因疗法betibeglogene autotemcel也于2019年在欧盟获得批准。该疗法通过慢病毒载体将功能性球蛋白基因引入红细胞中来治疗β-地中海贫血。在支持监管机构批准决定的两项汇总试验中，近80％的β-地中海贫血患者在治疗后至少12个月不再需要输血。Bluebird bio已经开始在美国启动滚动NDA申请，针对镰状细胞病的开发也在继续进行中。

调节T细胞

T细胞也为体外基因编辑提供了诱人的机会。

Sangamo在2010年就测试了这种疗法。在肿瘤免疫疗法风靡之前，Sangamo找到了一种调节T细胞来对抗传染病的方法，其体外编辑项目SB-728使用ZFN破坏收集到的T细胞中CCR5受体的表达。由于HIV借助CCR5受体进入T细胞，因此Sangamo认为这种方法可以保护T细胞免受HIV感染。2014年，主要研究者、宾夕法尼亚大学的Carl June教授（CAR-T细胞疗法先驱之一）和同事在《新英格兰医学杂志》上报道了Sangamo的基因编辑工具能够修饰CCR5，且是安全的，证明了使用ZFN制备改造T细胞的可行性。

尽管此后SB-728没有继续发展下去。但是，工程化T细胞在肿瘤免疫学中的潜能已经逐渐凸显（表2）。

来源：Nature Reviews Drug Discovery

诺华公司2017年获FDA批准的CAR-T疗法tisagenlecleucel（最初由Carl June教授及其同事开发）指明了如何使用重编程T细胞来靶向癌细胞。

在这项疗法中，研究人员将收集的T细胞在体外用编码CD19识别嵌合抗原受体（CAR）的慢病毒载体进行修饰。在将这些携带CD19 CAR的细胞重新注入患者体内后，CD19 CAR可以识别并破坏表达CD19的癌细胞。这种疗法对于B细胞急性淋巴细胞白血病和弥漫性大B细胞淋巴瘤具有长期持久的缓解作用。

但是，将这些CAR添加到T细胞中的方式存在一些问题。一方面，工程T细胞中内源性受体的持久表达会降低其杀灭癌细胞的效力。其次，T细胞也会受到其它信号的制约和平衡，从而导致其功能障碍和耗竭。很多研究人员都试图解决这些问题，而基因编辑技术提供了一个前进的方向。

2019年，June教授带来另一项里程碑研究。他与合作者使用CRISPR工程化的候选疗法NYCE T细胞在美国治疗了首例患者。研究团队首先使用CRISPR–Cas9敲除了编码内源性T细胞受体（TCR）的两个基因和编码PD1的基因，再使用慢病毒载体插入一个可识别癌症抗原NY-ESO-1的TCR转基因。（CARs仅能识别在癌细胞表面表达的抗原，而TCR可以识别更广泛的抗原。）

2月份，第一部分结果在Science上发表，显示了这种治疗方法在3例患者中的安全性和可行性。目前疗效数据仍在收集中。

此外，先进的编辑技术可能是现货型同种异体细胞疗法的关键，这种疗法的生产难度低于自体细胞疗法。

体内基因编辑

目前，体内基因编辑疗法管线已拥有了一系列多样化的项目。（表3）。

来源：Nature Reviews Drug Discovery

Sangamo的SB-913用于治疗一种罕见的遗传疾病——II型粘多糖贮积病（MPS II）。Sangamo力求这一疗法超越其它体内基因疗法产品，如Spark的voretigene neparvovec和Avexis的onasemnogene abeparvovec。先前的这些项目证明，基于腺相关病毒（AAV）的治疗途径在体内应用时可以将新基因递送到细胞核中，但这些转基因很少能整合到基因组中。而Sangamo希望通过SB-913疗法证明将缺失基因的功能性版本直接插入细胞染色体DNA中的可行性，同时，公司也希望能够通过一种强启动子来控制转基因的剪接，从而调控蛋白质的表达水平。

SB-913于2017年11月开始临床试验。不过，2019年2月，公司明确接受SB-913治疗的患者没有获得足够的益处。

除了插入基因，基于CRISPR技术开展研发的公司也在探索使用该编辑工具删除DNA。

例如，Editas Medicine（由张锋联合创立）和Allergan开发的EDIT-101使用CRISPR–Cas9来剪切Leber先天性黑蒙症10型（LCA10）失明患者的一部分突变CEP290，从而迫使机体产生功能蛋白，达到恢复视力的效果。这也是一项具有里程碑意义的研究。

通过这种尝试，Editas正在追随基因治疗先驱Spark Therapeutics的脚步，后者在2017年首次获得FDA批准，使用voretigene neparvovec治疗LCA2先天性失明。Spark通过选择眼科适应症避开了阻碍基因治疗领域的并发症。因为眼睛具有免疫特权，对外来载体和引入的转基因发生免疫反应的风险较低。而且从眼睛到身体其他部位的循环有限，从而降低了脱组织（off-tissue）编辑的风险。此外，已编辑的细胞不再更新，提高了产生长期效应的可能性。

Editas的共同创立者Doudna希望基于CRISPR–Cas9系统的开发也能利用这些相同的优势。

其他领先的体内编辑候选疗法也使用CRISPR–Cas系统来切割DNA。

甲状腺素（TTR）是一种转运蛋白，当其发生突变时可能会错误折叠并发生聚集，从而导致TTR介导的淀粉样变性。Intellia的领先候选疗法NTLA-2001使用CRISPR–Cas来敲除TTR基因。Intellia及其合作伙伴Regeneron希望通过降低TTR的表达来为患者提供终生治疗。

事实上，反义疗法和RNA干扰（RNAi）的先行者已经为靶向TTR的潜能提供了验证。2018年，FDA批准了Alnylam用于遗传性TTR介导的淀粉样变性的药物patisiran，这是有史以来首个获批的RNAi疗法（通过寡核苷酸结合TTR的mRNA，使其表达沉默）。此外，欧盟的监管机构还批准了Akcea Therapeutics和Ionis的inotersen，这是一种反义寡核苷酸，可在相同环境下达到类似的效果。

Intellia可以专注于展示CRISPR–Cas9的优势。例如，基因编辑途径是否会导致更低的TTR水平？基因编辑疗法能否有更好的安全性？单剂治疗能否更加有效？

许多最先进的体内编辑疗法都聚焦于罕见遗传疾病，在肝脏、肌肉和中枢神经系统中表达的基因是高度优先的治疗靶点，这部分与AAV载体的运输特性有关。此外，基因编辑也应用到了一些传染病的治疗中。

基因编辑在病毒中的应用也在进行。例如，Excision BioTherapeutics的CRISPR–Cas9候选药物即将进入临床开发阶段，它可将整合的HIV DNA从患者基因组中去除，感染HIV的患者可能不再需要接受抗逆转录病毒疗法。首个临床试验将在今年晚些时候开始。Precision Biosciences及其合作伙伴吉利德的一项基于大范围核酸酶的乙型肝炎病毒疗法有望于2021年提交IND。同时也有研究人员正在思考如何使用DNA切割方法来治疗COVID-19.。

关键问题

随着基因编辑试验结果的陆续揭晓，一些关键临床发现可能会对基因编辑疗法的发展产生巨大的影响。

首先，各类不同的编辑技术具有怎样的免疫原性？进行体内编辑所需的编辑工具和载体都是外源性的，因此可能会触发降低疗效甚至造成伤害的机体免疫反应。虽然AAV载体在基因治疗中的应用已将其风险大幅降低，但CRISPR–Cas系统是细菌来源的，目前尚不清楚患者的免疫系统会对其产生怎样的反应。

初步的免疫原性数据是混杂的。有分析显示，高达58%~78％的受试个体对不同的Cas9突变体具有预存的免疫力。而另一项使用了不同类型测量方法的研究发现，预估比例为2.5%~10％。

此外，最近的一项研究表明，对Cas9的预存免疫力可消除小鼠体内的基因组编辑细胞。但是，在人体中是否也如此还有待观察。

其次，基因编辑脱靶效应也是一个持续存在的问题。虽然基因编辑是特异性的，但仍然会在意想不到的位置切割DNA。这种情况的发生程度尚待讨论，此外，还需要更好的工具来评估脱靶编辑的范围和效果。

除此之外，基因编辑的长期作用也存在一些问题。基因操纵的稳定性以及结果可控性都是仍待解决的问题。对这些问题的研究非常重要，将为CRISPR未来的应用奠定基础。

驶向未来

基因编辑工具已逐渐变得更加多样化。例如，Beam Therapeutics希望使用哈佛大学David Liu等人许可的碱基编辑方法将CRISPR–Cas推向新的方向。Beam的平台可以替换DNA链中的碱基，而不是切除不需要的DNA（在疾病相关的遗传错误中，有一半以上是由单碱基变化引起的）。

此外，2013年，Doudna教授与其同事在一篇Cell论文中揭示了CRISPR可以与催化失活的dCas蛋白偶联。dCas9可以与效应域结合，以控制靶基因的表达，而不是切割DNA。

杜克大学基因编辑专家Charles Gersbach教授认为这些新型编辑工具可能会改变游戏规则。原因有以下三点：

首先，这些基因编辑方法的脱靶编辑效应可能更易于管理。调控基因表达的基因编辑策略的“脱靶效应“不会产生像意外切割非目标DNA一样的持久影响。

其次，这些下一代基因编辑工具还可以根据需求进行反向的调节性编辑。尽管一步到位的基因编辑疗法对于罕见的单基因疾病来说很振奋人心，但在其他疾病中，药物开发人员可能会想要随时间的推移能够调节基因编辑靶向活性。这有助于减轻患者、医生和监管机构对永久编辑可能引发的长期影响的担忧。

最后，许多常见疾病是由基因表达失衡导致的，因此，这些疾病可能更适合通过“调节性编辑“来纠正。

“我认为，未来会有一批新公司基于这些新基因编辑工具开展研发。基因编辑技术的临床应用才刚刚开始，仍有大量未知等待探索。” Gersbach教授展望道。

参考资料：1、Gene-editing pipeline takes off（来源：Nature Reviews Drug Discovery）
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