殊途同归：两篇论文共同揭示黄素依赖卤化酶催化芳香化合物碘化的反应本质
自然界中存在着大量含有不同卤化修饰（包括氟化、氯化、溴化和碘化）的天然产物分子。卤化修饰对于化合物的生物活性与成药性，是一个非常关键的影响因素，因此卤化修饰常见于很多药物分子。大多数天然产物的卤化修饰是由不同类型的卤化酶催化完成，包括卤过氧化物酶、二价铁/α-酮戊二酸依赖卤化酶、核黄素依赖卤化酶等。碘化修饰的天然产物尽管较少，但是多数具有重要的生物活性，如甲状腺素。在有机合成中，芳香碘化物通常作为一种重要的合成子，在金属催化的交联反应中应用非常广泛。然而，能够催化碘化反应的酶却鲜有报道。1966年报道了第一例甲状腺过氧化物酶（TPO），催化酪氨酸的苯环碘化合成甲状腺素。近年，两篇Nature子刊分别报道了两例黄素依赖卤化酶VirX1 （Nature Chem.，2019）和PltM （Nature Commun.，2019）具有催化芳香化合物碘化的功能。因此，探索其他卤化酶是否具备碘化功能极具研究价值和吸引力。
近日，上海交通大学林双君教授团队和中科院南海海洋研究所张长生研究员团队，分别独立发现了芳香化合物碘化反应背后的机理，均对自然界中是否真的存在黄素依赖碘化酶提出了疑问。结合前期报道的甲状腺过氧化物酶催化碘化的化学本质，为我们理解天然产物结构中的碘化修饰，提供了一种新的认识，并且开发了一个简单易行的芳香化合物碘化方法。
卤化酶催化碘化机理探索
林双君教授团队在探索PrnA（色氨酸7-卤化酶）对芳香性底物的卤化反应时，发现单独的辅酶黄素还原酶PrnF就可使多个芳香底物发生位置高度选择性的碘化反应，反应过程中不需要卤化酶PrnA的参与。首先，通过排除法证实，碘化反应的发生必须依赖于PrnF、NADH和FAD，三者缺一不可。随后利用PrnF对16种含有不同取代基团的吲哚、吡啶和喹啉化合物开展了碘化反应实验，结果表明多种富含电子的芳香化合物，比如2, 4-二羟基吡啶、3-羟基喹啉、6-羟基喹啉和10-羟基喜树碱等均可发生碘化反应（图1），并且碘化反应发生的位置均在羟基或氨基的邻位或者对位。此外，该研究同时发现，来源于大肠杆菌的黄素还原酶Fre同样可使吲哚发生碘化反应。综上表明：（1）黄素依赖的卤化酶PrnA与碘化无关；（2）黄素还原酶PrnF或Fre与碘化反应直接相关。
图1 黄素还原酶PrnF介导的碘化反应：底物和产物化学结构及转化率
为了探究到底是不是黄素还原酶催化的该反应，研究人员设计了一个两步反应体系，首先进行黄素还原酶催化的FAD还原反应，然后通过超滤膜除去酶，取反应液加入碘化钠和底物进行碘化反应。结果表明碘化反应不需要黄素还原酶PrnF（或Fre）的实质参与。据此推测是PrnF(或Fre)催化生成的FADH2先与氧气生成FAD-OOH，FAD-OOH快速分解产生H2O2进而氧化碘离子生成次碘酸，从而引发碘化反应（图2c）。于是向含有黄素还原酶的碘化反应体系中加入过氧化氢酶分解H2O2，碘化反应被明显抑制(图2a-iii)，因此推断黄素还原酶引发的碘化反应与H2O2的生成有关。同时，在纯H2O2的反应对照组中（不含黄素还原酶），底物也可以被碘化，并且随着H2O2浓度提高，碘化效率越高。为了进一步证实该反应是由次碘酸进行碘化反应的，利用氯化碘（ICl）产生次碘酸，而对照组氢碘酸（HI）却不能进行碘化反应，就此明确了次碘酸进行碘化的事实。综上表明碘化酶催化的碘化反应其实是黄素还原酶产生的H2O2将碘化钠氧化成次碘酸的结果。
图2 黄素还原酶引发的碘化反应机制： (a)确认H2O2在碘化反应中起作用，(b) 确认次碘酸在碘化反应中起作用，(c) 推测的由黄素还原酶介导的碘化反应机制。
中国科学院南海海洋所张长生教授组的研究有别于黄素还原酶介导的芳香化合物碘化反应，而是在研究天然产物台勾霉素生物合成途径中黄素依赖卤化酶TiaM催化双脱氯台勾霉素B碘化过程中，证实双脱氯台勾霉素B的碘化反应根本不需要卤化酶TiaM的参与，只需要在碘化钠、酸和空气存在的条件下，乙酸乙酯萃取即可完成双脱氯台勾霉素B发生碘化反应。首先以碘化钠为碘离子源在磷酸盐缓冲液中开展TiaM催化碘化反应研究，在TiaM碘化反应中观察到了单碘化台勾霉素4和双碘化台勾霉素5产生，然而在负对照中（酶被加热失活）同样发现了4和5的产生（图3），说明碘化产物不是直接由TiaM催化产生的。
图3 TiaM存在或失活的条件下都观察到台勾霉素B转化生成两个碘化产物4和5
为探明双脱氯台勾霉素非酶催化的碘化反应机理，开展了一系列相关研究，结果发现该反应只需要在碘化钠、酸和空气存在的条件下，进一步经乙酸乙酯萃取即可以产生碘化产物。根据实验结果，研究人员推测双脱氯台勾霉素的非酶碘化反应实际上是由两种途径生成的次碘酸介导的芳香化合物亲电取代反应（图4A，即林双君教授课题组验证的途径）；另一种途径可能是在酸性条件下由氧气介导产生次碘酸执行的芳香化合物碘化反应。这两种途径都是次碘酸进行的亲电芳香取代反应，那么就应该优先发生在芳香底物的富电子位置，然后对16种芳香底物进行了非酶碘化测试，结果表明其中9个带有羟基或氨基取代的芳香底物可以发生碘化反应（图4B）。
鉴于本研究的重要发现，林双君教授团队进一步对2019年报道的第一例黄素依赖型碘化酶VirX1（Nature Chemistry，2019）进行了验证。通过基因合成和蛋白表达获得了VirX1，并以论文中报道的吲哚为底物进行卤化反应测试。研究表明在反应体系中加入过氧化氢酶时碘化反应被完全终止，但不影响氯化和溴化反应的发生，同时缺失这个酶时碘化反应也能发生，因此推测VirX1催化的碘化反应同样是由H2O2介导的，并不是VirX1催化的。然后对与VirX1位于同一进化分支的两个蛋白，MBG（一致性60.63%）和NCV（一致性34.13%），进行体外生化表征，结果与VirX1一致。鉴于在PrnA和VirX1催化的碘化反应中都能观察到明显的过氧化氢酶抑制现象，推测此前报道的VirX1催化碘化反应，本质上只是源于黄素还原酶释放的双氧水，与VirX1本身无关。同时，进化树分析表明VirX1及其同源蛋白(MBG和NCV)只是色氨酸卤化酶超家族中一个新变种（图5），不太可能是真实的碘化酶。
图5 基于氨基酸序列构建的黄素依赖型卤化酶进化树
自然界中天然产物的碘化位置大都在芳香环的富电子位置，那么是酶催化的还是非酶催化的？林双君教授团队及张长生研究员团队的这两项研究结果揭示了一种芳香化合物碘化的反应机制，并且提出了自然界中是否真实存在"黄素依赖的碘化酶"的科学问题，同时提醒在研究黄素依赖型碘化酶时，如果需要黄素还原酶参与，必须做好对照反应，审慎考察。
文章来源
黄素还原酶引发碘化反应的相关论文第一作者及共同通讯作者为新乡医学院张玉阳讲师，通讯作者为上海交通大学林双君教授。详见：Yuyang Zhang*, Lin Chen, Hongping Chen, Tingting Huang, Qing Shi, Xiaozheng Wang, Yan Wang, Man-Cheng Tang, Ning-Yi Zhou & Shuangjun Lin*. Aryl C-H iodination: are there actual flavin-dependent iodinases in nature? Science China Chemistry 2021，https://doi.org/10.1007/s11426-021-1018-0
脱氯台勾霉素简易碘化方法的相关论文第一作者为中国科学院南海海洋研究所张海波副研究员，通讯作者为中国科学院南海海洋研究所张长生研究员。详见：Haibo Zhang, Liping Zhang, Imran Khan, Guangtao Zhang, Yiguang Zhu & Changsheng Zhang*. A simple and facileiodination method of didechlorotiacumicin B and aromatic compounds. Science China Chemistry 2021，https://doi.org/10.1007/s11426-021-1072-6
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作者简介
张长生，中国科学院南海海洋研究所研究员，国家杰出青年科学基金获得者，英国皇家化学学会会士。1994年于上海交通大学获学士学位，1997年于华东理工大学获硕士学位，2002年在德国乌帕塔尔大学获化学微生物学博士学位，2003-2008年在美国威斯康星大学麦迪逊分校进行博士后研究并担任Assistant Scientist。研究领域为海洋微生物活性次生代谢产物的天然发现、生物合成和结构改造等方面的研究工作，探索结构新颖、活性独特的微生物次生代谢产物的生物合成途径和所蕴藏的新颖生物合成酶反应机制及其在天然药物结构多样化方面的应用，研究成果发表于Science、J. Am. Chem. Soc.、Angew. Chem. Int. Ed.、Nat. Commun.等国际期刊。现任Natural Product Reports编委会成员。