红/近红外发光AIEgen实现Aβ沉积活体内早期精准示踪

华东理工大学化学与分子工程学院田禾院士团队梅菊副教授等利用廉价易得的原料，通过简便的合成路线制得了棒状两亲性红/近红外发光聚集诱导发光分子（AIEgen）AIE-CNPy-AD。该探针集Aβ沉积偏好的几何构型、两性离子和两亲性分子结构、扩展的D-π-A电子结构以及3D构象于一体，实现了阿尔茨海默病（AD）模型小鼠活体内Aβ沉积的高信噪比和高对比度显影及精确示踪。这一工作不仅为AD早期诊断和AD发展过程的高度可靠监测提供了理想替代方案，也为设计合成更多可用于活体内Aβ沉积示踪的高性能红/近红外发光AIEgens提供了思路。

原位、实时、精准地实现β-淀粉样蛋白（Aβ）沉积物的早期检测对于阿尔茨海默病（AD）的诊断和及时干预至关重要。光学成像在此方面极具潜力，然而，由于缺乏特异性的高性能成像对比剂，其在AD的诊断方面仍面临着极大挑战。受血脑屏障（BBB）穿透性差、激发/发射波长短以及聚集导致猝灭（ACQ）效应等限制，临床上广泛使用的金标准探针并不适用于Aβ沉积物的早期活体成像。

通过调研大量已报道的Aβ沉积物检测荧光分子探针的结构与性能，作者发现具有棒状几何构型和给-受体（D-A）电子结构的荧光探针通常表现出更好的Aβ沉积检测性能（图1A)。一方面，棒状结构探针在形态上与Aβ沉积物具有一定相似性，有利于探针与Aβ的结合，从而有益于其特异性检测。另一方面，具有D-A效应的探针对环境的亲疏水性敏感，当与富含β-折叠结构的淀粉样蛋白的疏水区域结合时，给出荧光增强信号。虽然这两个必不可少的结构特点可保证探针的基本性能，但其他缺陷仍严重影响这些探针的成像性能。譬如，大多数已报道的探针表现出ACQ效应，导致相对高的背景噪声和不够理想的信噪比。而且，像ThT中简单的D-A结构无法确保红或近红外（NIR）发射，从而无法避免生物体自发荧光的干扰也不能保证深层组织的穿透能力。基于此，作者梳理出可用于活体内Aβ沉积物早期精准检测的高性能荧光探针需要满足的四大要素（图1B）：（1）与β-折叠结构相匹配的几何构型；（2）可同时保证BBB穿透能力和高信噪比的平衡的亲疏水性；（3）确保荧光响应、长波长激发和发射以及大斯托克斯位移的强D-A效应；（4）可提升荧光响应性能、信噪比和成像分辨率的抗ACQ效应。换言之，若将有利于与Aβ沉积物结合的棒状几何构型、可确保强的Aβ沉积物结合性和良好的BBB穿透性的亲水性单元修饰的疏水骨架、可保证红/近红外荧光和低自发荧光干扰的拓展D-π-A电子结构和可确保聚集诱导发光（AIE）效应、高信噪比和对比度的3D构象巧妙融合在一个分子中，可能可同时满足以上四个要求（图1B）。

作为概念验证性工作，AIE-CNPy-AD依据如下“多管齐下”的策略设计（图1B）：在该分子中，给电子基团二甲氨基与受电子基团腈基和吡啶基以苄基和C=C双键为桥通过单键连接，形成大的3D棒状构型与D-π-A骨架。这一骨架将赋予探针以强的Aβ沉积结合力、高效的AIE特性和明亮的红/近红外荧光。进一步地，在上述疏水骨架上修饰亲水性丙磺酸基团，最终得到探针AIE-CNPy-AD。两性离子和两亲性将给予AIE-CNPy-AD低背景噪声、高信噪比和良好的BBB穿透能力。由于与传统的ACQ探针相比，AIE探针常具有光稳定性好及信噪比与分辨率高等优点，AIE-CNPy-AD的成像性能应较之传统ACQ探针更为优异（图1C）。

图1  “多管齐下”的设计原则。（A）具有棒状几何结构和D-A电子结构的Aβ检测探针的典型代表；（B）基于“多管齐下”设计策略合理构建的特异性检测Aβ沉积物的红/近红外AIE探针（AIE-CNPy-AD）；（C）通过尾静脉注射AIE-CNPy-AD对不同年龄AD模型小鼠脑内Aβ沉积物的体内成像示意图。

实验结果显示，精巧设计与简便合成的AIE-CNPy-AD具有典型的AIE性能，其最大吸收和发射波长分别为455和720 nm，表现出显著的近红外发射。AIE-CNPy-AD对淀粉样蛋白研究中典型模型蛋白—鸡蛋白溶菌酶（HEWL）的纤维态表现出明显高于天然态的荧光响应，而金标准探针ThT对纤维化和天然的HEWL表现出几乎同等的响应（图2）。而由于ACQ效应，微量的纤维化HEWL即可猝灭另一金标准探针ICG的荧光，使其难以被用于Aβ沉积的检测。进一步地，当加入Aβ原纤维后，AIE-CNPy-AD的荧光发射显著增强且蓝移至620 nm。明显地，AIE-CNPy-AD的背景荧光信号远低于ThT的，仅为ThT的1/35倍。与此同时，AIE-CNPy-AD与Aβ原纤维结合后的荧光强度为同等条件下ThT与Aβ原纤维结合后的荧光强度的1.4倍。如此，AIE-CNPy-AD的信噪比高达60，为ThT的10倍。AIE-CNPy-AD相较于ThT显著增强的信噪比可以解释如下：（i）一方面，恰当的亲水性使AIE-CNPy-AD在水溶液中分散良好，分子内的剧烈运动有效地耗散了激发态能量，从而降低了荧光背景信号；（ii）另一方面，AIE-CNPy-AD与Aβ_1‒42原纤维的强结合阻碍了分子内运动并激活辐射衰减通道，由于AIE效应而大大增强了荧光信号。此外，竞争性实验也表明相比于ThT，AIE-CNPy-AD对Aβ原纤维具有更高的结合力。

图2  AIE-CNPy-AD对Aβ原纤维的高特异性识别能力和强亲和力。（A）在AIE-CNPy-AD（λ_ex = 455 nm，c = 5 μM）和（B）ThT（λ_ex = 420 nm，c = 5 μM）的PBS溶液（pH = 7.4，含 0.5% DMSO）中逐步添加纤维状HEWL（0‒95 μM）的发射光谱。（C）探针AIE-CNPy-AD、ThT和ICG与不同浓度的纤维状HEWL和天然 HEWL 共存时的I/I₀‒1，c = 5 μM。（D）预先制得的Aβ_1‒42原纤维的TEM图像。插图为Aβ_1‒42原纤维的放大TEM图像。（E）在AIE-CNPy-AD的 PBS溶液（pH = 7.4）中逐步添加Aβ_1‒42原纤维的发射光谱，λ_ex = 455 nm，c = 5 μM。（F）ThT和AIE-CNPy-AD分别与Aβ_1‒42原纤维结合或不结合时的荧光强度柱状图。（G）AIE-CNPy-AD对多种氨基酸及多肽等的荧光响应（I/I₀）。（H）AIE-CNPy-AD和ThT的I_max/I与AIE-CNPy-AD的浓度关系图。

令人满意的是，AIE-CNPy-AD对活体脑组织中的Aβ沉积亦具有优异的特异性示踪能力（图3‒图5）。尾静脉注射AIE-CNPy-AD仅5分钟后（图3），2.5月龄的5*FAD小鼠大脑中的荧光信号（图3A）即已明显强于同月龄的野生型小鼠脑中的（图3B）。如荧光图像的半定量分析所示，特别是随着荧光信号的衰减，从5*FAD小鼠和野生型小鼠脑区记录的信号强度差异被进一步放大（图 3C）。相似地，注射了AIE-CNPy-AD的6月龄APP/PS1小鼠脑区同样呈现出强烈的荧光信号。此外，6月龄APP/PS1与同月龄野生型小鼠之间的信号差异非常显著（图3D‒3F）。这一结果充分显示了AIE-CNPy-AD优异的BBB穿透性能、深层组织穿透能力、良好的抗生物体自发荧光干扰的能力以及高对比度和高保真度示踪Aβ沉积的能力。

图3  不同品系活体小鼠中Aβ斑块的体内成像。（A）5*FAD小鼠（2.5月龄）和（B）野生型小鼠（2.5月龄）在尾静脉注射AIE-CNPy-AD前后不同时间点的荧光图像（2.0 mg/kg）。（C）尾静脉注射AIE-CNPy-AD（2.0 mg/kg）后，5*FAD小鼠和野生型小鼠脑区的相对荧光信号[F(t)/F(pre)]。（D）APP/PS1小鼠（6月龄）和（E）野生型小鼠（6月龄）在尾静脉注射AIE-CNPy-AD前后不同时间点的荧光图像（2.0 mg/kg）。（F）尾静脉注射AIE-CNPy-AD（2.0 mg/kg）后，APP/PS1小鼠和野生型小鼠脑区的相对荧光信号[F(t)/F(pre)]，λ_ex = 500 nm，λ_em = 620 nm。（C）和（F）中的所有数据均显示为平均值± s.d.。两组之间的比较采用t检验法，*P < 0.05被认为是显著的，**P < 0.01被认为是非常显著的。

为进一步验证AIE-CNPy-AD早期示踪Aβ沉积的能力，作者系统研究了AIE-CNPy-AD在2、3、4、6月龄的年轻APP/PS1转基因小鼠和同月龄野生型 (WT) 小鼠中的荧光响应行为（图4）。结果表明，转基因小鼠与野生型小鼠之间的信号差异在2和3月龄时并不明显，而在4月龄时则十分明显。同时，转基因AD小鼠脑区的荧光信号强度与其年龄呈正相关（图4A）。更具体地说，注射AIE-CNPy-AD20分钟后，4月龄APP/PS1转基因小鼠的F(t)/F(Pre)值为其同月龄野生型小鼠的1.86倍，而6月龄APP/PS1转基因小鼠的F(t)/F(Pre)值为其同月龄野生型小鼠的2.06倍（图4B）。同时，不同月龄的野生型小鼠脑区的荧光信号间的差异并不明显（图4C）。此外，2月龄和3月龄的APP/PS1转基因小鼠的F(t)/F(Pre)值几乎与年龄匹配的野生型小鼠相同（图4D）。这些成像结果清楚地表明AIE-CNPy-AD能够胜任早期精准诊断AD的任务。据推测，AD早期药物干预失败的原因可能是该阶段的干预还不够早，说明高效捕捉AD的生物学表现而不是临床表现至关重要。可见，利用AIE-CNPy-AD获得的实验结果非常有意义，因为据报道APP/PS1转基因小鼠通常从5月龄才开始表现出记忆缺陷，这是早期的临床表现，说明AIE-CNPy-AD具有在APP/PS1转基因小鼠出现早期AD生物学表现阶段也就是临床表现出现之前诊断AD的潜力。

图4  不同年龄APP/PS1小鼠中Aβ斑块的活体内示踪。（A）不同月龄（2、3、4、6月龄）的APP/PS1小鼠或（C）相应月龄的野生型小鼠在尾静脉注射AIE-CNPy-AD（2.0 mg/kg）之前或之后不同时间点的荧光图像。尾静脉注射AIE-CNPy-AD后（B）不同月龄APP/PS1小鼠或（D）野生型小鼠脑区的相对荧光信号[F(t)/F(pre)]（2.0 mg/kg）。AIE-CNPy-AD：λ_ex = 500 nm，λ_em = 620 nm。 

对预先注射了AIE-CNPy-AD的小鼠脑切片的离体观测进一步确认了AIE-CNPy-AD特异性结合活体小鼠脑中Aβ沉积并以高分辨率和高对比度示踪Aβ沉积的能力。如图5所示，可清楚地观察到6月龄APP/PS1转基因小鼠脑切片中的Aβ沉积比4月龄APP/PS1转基因小鼠中的更大更丰富，而在2月龄和3月龄APP/PS1转基因小鼠以及所有年龄匹配的野生型小鼠的脑切片中未发现明显的Aβ沉积信号。显然，正如完美重叠的绿光（抗体）和红光通道影像（AIE-CNPy-AD）所示的那样，AIE-CNPy-AD 确实对活体内的Aβ沉积物具有高保真度和特异性标记的能力。

图5  预先注射了AIE-CNPy-AD的小鼠的脑切片的离体观测。（A‒E）4月龄APP/PS1转基因AD小鼠和（F‒J）6月龄APP/PS1转基因AD小鼠脑切片的荧光染色。小鼠通过尾静脉注射预注射AIE-CNPy-AD，被处死后制备冷冻切片，依次用抗β淀粉样蛋白1-42 [mOC64]（ab201060）、Alexa Fluor® 488标记的山羊抗兔二抗染色（ab150077）和Hoechst 33342染色。（A, B, F, G）三个通道的合并图像；（C, H）蓝光通道：Hoechst 33342，λ_ex = 405 nm，λ_em = 461 nm；（D, I）绿光通道：Alexa Fluor® 488 标记抗体，λ_ex = 488 nm，λ_em = 519 nm；（E, J）红光通道：AIE-CNPy-AD，λ_ex = 488 nm，λ_em = 620 nm。（A, F）100倍放大率；（B‒E, G‒J）1000倍放大。

进而，作者利用分子对接模拟计算揭示了AIE-CNPy-AD和Aβ原纤维或单体之间的相互作用并阐明了AIE-CNPy-AD特异性检测Aβ原纤维的具体工作机制。计算结果充分验证了其设计理念的合理性（详见原文）。

综上，除了具有优异的BBB穿透能力、良好的深层组织穿透性、高信噪比和高保真成像能力等优点外，该AIE探针还具有以下优点：（1）结构简单、原料价廉、制备简便且成本低；（2）体内成像能力普适性高，不受小鼠品系限制；（3）在临床表现发生前即可实现Aβ沉积的精准体内追踪；（4）与所有已报道的荧光探针相比，探针在更早阶段示踪了Aβ沉积；（5）其细胞相容性和活体内的生物相容性令人满意，探针可用于活体研究和临床应用。这一工作不仅阐明了可在活体内精准示踪Aβ沉积的高性能荧光探针的合理设计原则，还为早期诊断AD并找到早期药物干预的时机提供了一种有前景的工具。 

详见：Wang Y, Mei D, Zhang X, Qu DH, Mei J. Visualizing Aβ deposits in live young AD model mice with a simple red/near-infrared-fluorescent AIEgen. Sci. China Chem., 2021, 64, https://doi.org/10.1007/s11426-021-1113-0

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