东华大学沈明武/史向阳团队：树状大分子-Fe(III)配合物用于胰腺癌的增强铁死亡治疗

胰腺癌确诊后的五年生存率低于10%，是预后最差的恶性肿瘤之一，被称为“癌症之王”，其临床症状隐匿且不典型，早期确诊率不高，手术死亡率较高，治愈率低，对传统的放疗和化疗有耐药性。因此寻找高效应对胰腺癌的新策略至关重要。东华大学沈明武研究员和史向阳教授等人提出一种树状大分子-Fe(III)配合物纳米体系，利用第5代聚酰胺-胺树状大分子作为初始平台，在其内部包裹纳米金颗粒，在其外围修饰配体8-羟基喹啉进而螯合Fe(III)离子。该纳米颗粒可作为表达p53蛋白的质粒DNA的载体，通过Fe(III)离子引起的芬顿反应实现的化学动力学治疗和p53基因递送引起的细胞凋亡和氧化应激，进而实现体外胰腺癌细胞和体内胰腺癌肿瘤模型的增强铁死亡治疗。

近年来，铁死亡（ferroptosis）作为一种新的细胞死亡方式在肿瘤治疗领域引起了广泛关注，有研究人员发现胰腺癌细胞系PANC-1细胞对铁死亡敏感。铁死亡最早是由哥伦比亚大学Stockwell在2012年提出，指的是铁引起的活性氧（ROS）异常堆积而导致氧化还原稳态失调的细胞死亡方式。铁死亡发生的关键在于铁与肿瘤细胞内的过氧化氢（H₂O₂）发生Fenton反应产生活性氧，进而转变为脂质过氧化物（LPO），再转变为有毒的脂质自由基，导致细胞膜破碎，从而诱导肿瘤细胞发生铁死亡。基于铁死亡的发生原理，研究人员设计了许多铁基纳米材料，通过在其中融入特定的小分子螯合铁离子（如8-羟基喹啉（8-HQ），单宁酸（TA），没食子酸（GA）等），实现肿瘤细胞内部铁离子过载从而调控肿瘤细胞的铁死亡。在肿瘤细胞内部成功实施铁介导的铁死亡，依赖于细胞内部有效的铁浓度和H₂O₂水平。一般情况下，肿瘤细胞内的H₂O₂含量仅为50~100 μM，使得Fenton反应产生的活性氧的量无法显著抑制肿瘤细胞的生长，因此需要通过联合其它的细胞死亡方式，协同实现肿瘤的铁死亡治疗。

铁死亡通路与细胞凋亡通路存在许多交汇之处，其中抑癌基因p53扮演着关键作用。p53除了参与促进细胞凋亡和抑制肿瘤血管生成的细胞过程外，最近的研究表明它也可以下调Xc^–转运体的关键成分SLC7A11蛋白的表达，使得导致进入细胞内的胱氨酸的含量下降，进一步使得谷胱甘肽的合成量减少，从而增强活性氧介导的铁死亡。因此，设计合理的纳米载体平台，同时介导p53基因传递和铁离子过载有望实现增强的肿瘤铁死亡。

图1  Fe-Au DENP-HQC/p53复合物的制备及用于胰腺癌的凋亡/铁死亡联合治疗示意图 

在众多纳米材料中，聚酰胺胺树状大分子（PAMAM）是一类独特的纳米载体材料，它高度枝化，具有内部空腔，丰富的外围氨基，易修饰性和低的细胞毒性等优势，可将其作为载体系统用于造影剂和药物、基因的递送。其中在基因递送方面，树状大分子包裹金纳米颗粒能够显著增强基因递送效率、提高树状大分子的细胞相容性。基于胰腺癌PANC-1细胞对铁死亡敏感的特点和课题组前期以树状大分子作为基因载体的研究成果，东华大学沈明武研究员/史向阳教授团队构建了一种PAMAM-Fe(III)配合物介导的质粒递送纳米平台用于胰腺癌的增强铁死亡治疗及荧光成像（图1）。

研究团队首先通过EDC/NHS化学耦合反应将8-羟基喹啉-2-羧酸（8-HQC）修饰在第5代树状大分子表面用作铁的螯合剂（G5.NH₂-HQC）；再以此为模板通过硼氢化钠还原法包裹金纳米粒子得到Au DENP-HQC；接着通过金属螯合作用将铁与8-HQC相连得到Fe-Au DENP-HQC；最后利用静电吸附作用在其表面负载质粒p53（同时编码p53基因和EFGP基因）制备Fe-Au DENP-HQC/p53复合物。

通过¹H NMR、UV-vis和元素分析实验（图2A-D）等证实了Fe-Au DENP-HQC的成功制备，其中金核的粒径约为1.9 nm。制备的Fe-Au DENP-HQC在水、PBS以及培养基（DMEM）中具有良好的胶体稳定性（图2E），能够在肿瘤微环境下快速释放Fe（21.9%）（图2F）。MB降解实验（图2G）初步证实所合成的纳米载体能够在肿瘤微环境内部发生类Fenton反应，产生有毒的羟基自由基（･OH）用于肿瘤的化学动力学治疗（CDT）。

图2 （A）G5.NH2-HQC、HQC-Fe、Au DENP-HQC和Fe-Au DENP-HQC的紫外谱图；Fe-Au DENP-HQC的（B）TEM图、（C）金核的粒径分布直方图和（D）元素（铁，金和氧）mapping分析图；（E）Fe-Au DENP-HQC的水、PBS以及培养基溶液的水合粒径分布图；（F）不同条件下Fe的累积释放曲线；（G）Fe-Au DENP-HQC在模拟酸性TME条件下引起MB降解的紫外可见光谱图 

该研究以人源胰腺癌PANC-1细胞为模型进行了体外、体内研究。基因转染实验证实复合物在N/P=15时表现出了最佳的基因转染效率。在细胞毒性实验（图3A-B）验证了Fe-Au DENP-HQC/p53复合物表现出良好的细胞相容性，当引入甲磺酸去铁胺（DFO，铁死亡抑制剂，可以通过与铁发生螯合作用，抑制铁引起的铁死亡）后，载体组的细胞活力明显上升，初步说明Fe-Au DENP-HQC载体具有良好的抗癌活性，可能通过Fe(III)介导的CDT诱导癌细胞死亡。在相同条件下的Fe-Au DENP-HQC/p53复合物对癌细胞的抑制率比Fe-Au DENP-HQC载体高得多，说明Fe-Au DENP-HQC介导的CDT和p53传递诱导的基因治疗相结合可以对癌细胞产生增强的抑制作用。细胞凋亡实验（图3C-D）表明Fe-Au DENP-HQC/p53复合物在诱导PANC-1细胞发生铁死亡的同时还诱导了细胞凋亡。

图3  不同Fe浓度的Fe-Au DENP-HQC、Fe-AuDENP-HQC/p53分别与（A）L929细胞和（B）PANC-1细胞共培养24 h后细胞活力检测；（C）凋亡细胞统计百分比图；（D）PANC-1细胞与不同化合物共孵育后的细胞凋亡流式图 

研究团队选择以同时含有DFO和Fe-Au DENP-HQC的材料作为对照，验证铁介导的铁死亡。从图中可以看出（图4A-C），经Fe-Au DENP-HQC/p53复合物处理后的PANC-1细胞表现出最显著的ROS、LPO的产生以及GSH的消耗，而含有DFO的实验组的效果与空白对照组相差不大，表明铁介导的铁死亡作用受到了限制，与细胞毒性实验结果一致。蛋白质印迹（WB）实验（图4D-E）也证实了p53引起的SLC7A11、GPX-4蛋白表达降低和p53、PTEN蛋白的表达升高，说明p53对铁死亡的促进作用是通过下调SLC7A11蛋白的表达进行的（图4F）。

图4  DCFH-DA探针染色PANC-1细胞的（A）CLSM图及（B）定量分析图；（C）细胞内GSH水平定量图；（D）铁死亡相关蛋白及凋亡相关蛋白表达水平的变化；（E）D图中相应的蛋白表达的水平的定量数据；（F）Fe-Au DENP-HQC/p53复合物的细胞毒性作用机制 

随后，研究团队构建了胰腺癌PANC-1裸鼠皮下瘤模型，评价Fe-Au DENP-HQC/p53复合物的离体荧光成像和体内抗肿瘤效果。研究发现，Fe-Au DENP-HQC/p53复合物的肿瘤抑制效果最明显（图5A-C）。荷瘤鼠和健康小鼠的主要器官经H&E染色均未观察到明显损伤，说明其生物安全性较好。对肿瘤组织进行H&E（图5D）和TUNEL染色（图5E），可以发现最终材料组的小鼠肿瘤部位的细胞坏死和凋亡程度（66.4%）最显著。对血管生成因子VEGF（图5F和图5H）和CD31（图5G和图5I）进行免疫荧光染色，结果表明p53抑制了肿瘤部位的血管生成，进一步表明Fe-Au DENP-HQC/p53复合物所表现出的协同治疗效果远高于单一模式的治疗。肿瘤组织与细胞WB实验结果（图5J-K）证实了p53基因在体内的表达使得SLC7A11、GPX-4蛋白表达降低和p53、PTEN蛋白的表达升高。小鼠的离体荧光成像实验结果（图5L）中，Fe-Au DENP-HQC/p53注射的小鼠肿瘤相对于肝脏和肾脏具有更高的荧光强度。以上实验结果均说明Fe-Au DENP-HQC/p53复合物中的p53基因在体内进行了转染，表明其不仅实现了凋亡增强的铁死亡肿瘤治疗效果，并且可以用于离体荧光成像。

图5 （A）体内抗肿瘤治疗示意图；不同治疗组小鼠在21天内的（B）体重变化情况和(C)相对肿瘤体积变化；（D-G）各组治疗第21天肿瘤切片的H&E、TUNEL、VEGF及CD31染色结果；（H）VEGF与（I）CD31的定量结果图；（J，K）肿瘤组织中蛋白的表达情况；（L）PANC-1肿瘤小鼠体内（上）和离体（下）荧光成像 

该研究设计的Fe-Au DENP-HQC/p53纳米体系具有多个优势：1）通过Fe(III)参与的芬顿反应引起的CDT和p53 pDNA递送引起的细胞凋亡以及氧化应激协同实现了胰腺癌模型的增强铁死亡治疗；2）通过基因治疗介导的EGFP在体内的表达，所设计的Fe-Au DENP-HQC/p53纳米复合物能够用于肿瘤的荧光成像。树状大分子-铁(III)配合物具有良好的生物相容性，有望作为载体系统应用于其它类型肿瘤的增强铁死亡联合治疗。

东华大学化学化工与生物工程学院硕士生马文静为第一作者，史向阳教授与沈明武研究员为共同通讯作者。详见: Wenjing Ma, Yue Gao, Zhijun Ouyang,Yu Fan, Hongwei Yu, Mengsi Zhan, Han Wang, Xiangyang Shi*, Mingwu Shen*. Apoptosis-enhanced ferroptosis therapy of pancreatic carcinoma through PAMAM dendrimer-iron(III) complex-based plasmid delivery. Sci. China Chem., 2022, doi: 10.1007/s11426-021-1191-3

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通讯作者简介

史向阳 东华大学化学化工与生物工程学院教授，博士生导师。1998年毕业于中国科学院感光化学研究所，获博士学位；先后在清华大学、德国马普胶体与界面研究所、美国加州州立大学洛杉矶分校和美国密歇根大学做博士后、访问学者、研究员和研究助理教授。主要从事树状大分子纳米医学、生物材料研究，以第一作者或通讯作者在Chem. Rev.、Chem.Soc. Rev.、Prog. Mater. Sci.、Adv. Mater.、ACS Nano、Adv. Funct. Mater.、Nano Today、Sci. China Chem.等国内外著名期刊发表SCI学术论文447篇。2008/2013年获上海高校特聘教授（东方学者）及跟踪计划，2011年教育部新世纪优秀人才，2018年上海市领军人才，2019年上海市优秀学术带头人。2014年获第五届中国侨界贡献奖创新人才奖；2017年获上海市科技进步奖一等奖；2018年获上海市自然科学奖一等奖。2019-2020年，爱思维尔中国高被引学者。

沈明武 东华大学化学化工与生物工程学院，研究员，博导。2001年毕业于清华大学，获博士学位；2003-2004年，美国密歇根大学安娜堡分校访问学者；2006-2008年，美国密歇根大学安娜堡分校副研究员；2008-2017年东华大学副研究员；2017年以来，东华大学研究员。主要从事有机/无机杂化纳米材料在纳米医学领域的应用基础研究。共发表SCI期刊论文200余篇，获授权中国发明专利19项。获2017年上海市科技进步奖一等奖和2018年上海市自然科学奖一等奖等奖项。