谭英、刘晓刚、尹军三个课题组合作成果：多转子和氢键作用协同策略构建高敏感近红外粘度探针

细胞粘度与细胞内众多的生理病理过程密切相关。利用荧光探针技术检测细胞微环境内粘度的变化，对于研究细胞功能、应变机制及疾病治疗具有重要意义。相比用于细胞中较高粘度区域检测的荧光探针，开发能够检测细胞极低粘度区域以及细微粘度变化的荧光探针是一个具有挑战性的课题。近日，清华大学深圳国际研究生院谭英教授、新加坡科技设计大学刘晓刚教授、华中师范大学尹军教授团队合作，采用“多转子与氢键作用”协同策略设计了一种近红外高灵敏粘度荧光探针，实现了可视化药物刺激引起的细胞质粘度变化，并实时监测细胞自噬过程中溶酶体的粘度变化。该工作为构建高灵敏性粘度荧光探针、探索细胞功能提供了一种合理的分子设计策略。

细胞粘度与多种扩散介导的细胞过程密切相关：细胞质的粘度影响着细胞内/细胞间的信号转导，活性物质/代谢物的运输以及生物大分子之间的相互作用。而亚细胞水平的粘度与细胞的生理活动密切相关。例如，线粒体功能障碍时的粘度变化会干扰三羧酸循环等代谢过程，溶酶体贮积症中生物大分子的积累也会引起粘度的变化。研究表明，细胞内粘度的异常变化与多种疾病的发生有关。因此，精确监测细胞内的粘度变化对于细胞功能研究和疾病诊断技术的发展至关重要。

与传统的量化大体积粘度的机械方法如落球粘度计、活塞粘度计和旋转粘度计相比，荧光粘度传感器具有高分辨率、快速响应和实时活体监测的特点，被认为是传感细胞内粘度变化的有效方法。这类荧光探针被广泛地应用于标记溶酶体（50~90 cP）、线粒体（60~110 cP）、内质网（约 129 cP）和细胞膜（200~300cP）等多种高粘度区域，而鲜有粘度探针研究具有低/超低粘度性质的细胞区域。此外，除了细胞低粘度的区域外，在细胞生理过程中的微小粘度变化也是反映细胞是否正常的重要指标，例如，溶酶体发生自噬过程以及用地塞米松等药物刺激细胞后，溶酶体粘度增加约 20cP。因此，开发具有高灵敏度的粘度探针，用于检测超低粘度区域和微小粘度变化，对于深入研究相关的细胞功能及生理过程具有至关重要的意义。

近日，清华大学深圳国际研究生院谭英教授、新加坡科技设计大学刘晓刚教授、华中师范大学尹军教授合作，提出了“多转子与氢键作用”协同策略设计了一例近红外高灵敏粘度探针。该工作统计了目前报道的基于氟硼二吡咯（BODIPY）分子的转子粘度探针，分析了荧光探针分子结构与发射光谱及粘度灵敏度（x，Förster-Hoffmann 方程计算得出）之间的关系（如图1）。调查结果表明，多转子分子通常具有较高的粘度敏感性，对BODIPY β 位点和 γ位点的共轭修饰可以促进荧光发射的红移，而对 α 位点修饰对荧光光谱的影响程度较小。

图1. 不同位点修饰用不同取代基修饰的BODIPY探针的粘度灵敏度（x）和最大荧光发射峰值的统计图。

图2. （a）不同胺基取代的BODIPY粘度探针的结构式；（b）探针1~9的紫外吸收光谱；（c）探针1荧光强度随粘度变化的荧光光谱；（d）探针9荧光强度随粘度变化的荧光光谱；（e）探针荧光强度与粘度值的线性拟合数据；（f）探针粘度灵敏度系数（x）统计图。

基于上述统计结果，作者在含有苯基转子的BODIPY染料上引入具有可旋转碳-碳键的N,N-二甲氨基苯乙烯单元，构建具有近红外荧光发射性质的多转子体系，并且在BODIPY支架的另一端，采用各种胺基供体（包括含杂原子的环胺）来调节与水介质的氢键作用程度（图2a）。光物理实验结果显示，探针1~9均表现出优异的近红外荧光发射性质。而低粘度（0.89~19.53cP）实验表明，与探针1~6的低粘度响应能力相比（如图2c），胺基供体与水介质存在氢键作用的探针9，其荧光强度随着溶液粘度的增大显著增强（如图2d）。根据Förster-Hoffmann 方程计算得出，探针9具有1.54的高灵敏度系数（如图2e）。量子化学计算结果表明，该高粘度敏感性归因于探针与溶剂分子之间的氢键作用；这种作用增加了探针旋转片段的有效体积，增大其与环境之间的相互作用。由上述统计数据可知（图1），探针9是在低粘度区域工作的最灵敏的近红外探针之一。

基于良好的体外实验结果，探针9被用于细胞成像实验。研究表明，细胞质通常具有较低的粘度值（3.40 cP），其粘度变化与细胞骨架的变化有关（如图3a），而探针9能够响应低粘度范围（0.89~19.53cP）的粘度变化。因此，作者将探针9用于可视化细胞质的粘度变化。实验结果表明，探针9能够通过荧光强度变化有效地检测不同细胞由诺考达唑和紫杉醇引起的轻微粘度变化（如图3b）。

图3. （a）探针9检测细胞质粘度变化示意图；（b）探针对诺考达唑和紫杉醇处理后的HeLa细胞和HepG2细胞的成像图。

此外，自噬过程（如溶酶体自噬和线粒体自噬）与细胞调节代谢功能、维持营养平衡以及分解受损成分等多种生理过程相关。研究表明溶酶体自噬过程会引起微小的粘度变化（< 20 cP）。如前所述，具有高灵敏度的荧光探针不仅能检测低粘度介质的变化，而且能传感高粘度区域的微小粘度变化。因此，作者进一步考察了探针9在可视化自噬过程中溶酶体粘度变化的可能性。实验结果表明，探针9在溶酶体自噬前后具有良好的溶酶体靶向能力。随后，作者将探针9用于检测自噬过程中的粘度变化。采用绿色荧光蛋白(GFP）标记膜锚定的LC3并获得GFP-LC3，用于追踪修饰质粒中的自噬小体，而用探针9标记溶酶体，通过饥饿条件诱导细胞发生自噬。结果表明，当自噬发生30~60 min时，自噬小体逐渐形成；随着孵育时间延长至120 min时，自噬小体和溶酶体之间逐渐融合，该过程引起溶酶体粘度的增加，使探针9表现出增强的荧光信号（如图4）。为了进一步使用Bafilomycin A1（Baf A1）作为质子泵抑制剂抑制细胞自噬，验证了探针9可视化溶酶体自噬过程粘度变化的能力。

图4. 探针9监测由饥饿条件诱导细胞自噬过程中的溶酶体粘度变化。

论文第一作者为李东洋、沈天若和薛晓琪，通讯作者为清华大学深圳国际研究生院谭英、新加坡科技设计大学刘晓刚、华中师范大学尹军。详见：Dongyang Li,Tianruo Shen, Xiaoqi Xue, Weijie Chen, Wenjun Tao, Weijie Chi, Sheng Hua Liu, Ying Tan*, Xiaogang Liu*, Jun Yin*. Synergistic effects of multiple rotors and hydrogen-bond interactions lead to sensitive near-infrared viscosity probes for live-cell microscopy. Sci. China Chem., 2023, DOI: 10.1007/s11426-023-1661-6.

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【通讯作者简介】

谭英，清华大学深圳国际研究生院生物医药与健康工程研究院副教授、博士生导师。2010年博士毕业于华中师范大学，2010年至2012年于清华大学从事博士后合作研究，2016年至2017年于新加坡国立大学做访问学者。研究方向包括肿瘤相关的人工智能、化学生物学、生物信息学，围绕药物分子（小分子、核酸、多肽）的研发及作用机制、生物传感器与分子诊断、人工智能与生物信息学等领域展开研究。在Chem、J. Am. Chem. Soc.、Nat. Mach. Intell.等期刊上发表论文90余篇。

刘晓刚，新加坡科技设计大学科学、数学与技术系助理教授，博士生导师。2014年获剑桥大学物理学博士学位，2017年加入新加坡科技设计大学担任助理教授，开展独立研究。研究团队通过理论计算和化学大数据相结合的方式，系统地研究功能化荧光化合物的工作原理，总结荧光团的构效关系，提出开发新型染料的设计法则，并探索其在生物成像、生化检测、化学教育方面的应用。目前在Chem. Soc. Rev.、J. Am. Chem. Soc.、Angew. Chem. Int. Ed.等期刊发表学术论文100余篇。

尹军，华中师范大学化学学院教授。主要从事三个方面的研究工作：（1）有机近红外荧光探针结构优化与功能调控；（2）植物活体成像分析与荧光标记；（3）绿色合成与纳米农药智能控释。在Sci. China Chem.、J. Am. Chem. Soc.等期刊发表论文100余篇。曾获湖北省自然科学二等奖、《中国化学快报》优秀青年学者奖。担任国际期刊Advanced Agrochem副主编、Chinese Chemical Letters编委。

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