【PROTAC】新药开发系列（四） 透膜降解AR和FKBP12

上两篇文章介绍了RaymondJ. Deshaies和CraigM. Crews等人在2001和2003年的开创性工作。他们合理地利用与泛素连接酶E3体系SCF（Skp1-Cullin-Fbox）结合的10肽，加上甲硫氨酰氨肽酶2（MetAP2）共价抑制剂Ovalicin、雌雄激素受体（ER和AR）底物雌二醇（Estradiol,E2）和二氢睾脂酮（Dihydroxytestosterone, DHT），设计合成了用于降解MetAP2、ER和AR的PROTAC分子。蛋白试验验证了PROTACs可快速降解目标蛋白。

图1 PROTAC泛素化降解机制

但遗憾的是，由于使用的10肽上有磷酸化的丝氨酸，导致PROTAC分子都无法透过细胞膜，为了验证细胞内的目标蛋白降解活性，研究人员不得不采用显微注射法，把PROTAC分子溶液注射到每个细胞中，然后观察目标蛋白降解效果。

图2 PROTAC的合成路线图

为了解决这个问题，研究者继续探索。他们发现一个7肽（ALAPYIP）链接上一个D-Arg精氨酸多聚体可以使得PROTAC成功透过细胞膜，且不被非特异性蛋白水解。研究者利用另外一个E3体系Von Hippel Lindau tumor suppressorprotein(VHL)准备降解AR和另外一种新的蛋白——抗免蛋白FKBP12(FK506 binding protein)。根据PROTAC的设计方式，他们采用AR的天然底物DHT和FKBP12（F36V突变体）抑制剂AP21998，用Linker将其与多聚精氨连接的7肽组合起来，形成了PROTAC-4和PROTAC-5。

图3 FK506与FKBP12的结合

研究发现，FKBP12和各类心血管疾病有关。抗免蛋白FKBP12与FK506他克莫司（免疫抑制剂）形成的复合物可抑制钙调神经磷酸酶（Calcineurin）活性，从而阻断T淋巴细胞转导途径中的信号转导。FKBP12与雷帕霉素（免疫抑制剂）形成的复合物可抑制mTOR活性。去年Blood文章报到，雷帕霉素和他克莫司可以阻断FKBP12与ALK2的结合，用以增加铁调素，并增强受体对炎性配体激活素A的反应性。铁调素是一种小分子多肽，主要由肝细胞合成，作用于肝脏、小肠和网状内皮系统，传递铁代谢调节信号，调控机体铁平衡。

图4 AP21998类似物与FKBP12的结合

为降解AR和FKBP12，研究者分别利用了AP21998和二氢睾脂酮(Dihydroxytestosterone, DHT)，通过中间的Linker连接多聚精氨酸的7肽，设计了PROTAC-4和PROTAC-5。降解AR的PROTAC设计类似上篇文章，只是多肽段换成了7肽。降解FKBP12的PROTAC则是从抑制剂AP21998含有羧基的一端链接Linker的。从AP21998类似物与FKBP12的晶体复合物，如图4，可以发现Linker应该是从红色圈部分链接出。因为分叉的芳环另外一边是一个大的疏水空腔，用来匹配AP21998的疏水芳环端。

这次，研究者并没有采用显微注射法，而是直接在细胞培养皿中加入药物。对于PROTAC-4的细胞内降解试验，他们使用了稳定表达增强绿色荧光蛋白（EGFP）融合的突变体（F36V）FKBP12的HeLa细胞系，通过细胞内荧光的损失来监测FKBP12的蛋白水解。在细胞试验中，仅加入DMSO的前后2.5小时观察细胞荧光没有变化，如图5中A、B所示，说明DMSO不降解目标蛋白。但在加入25uM的PROTAC-4的前后2.5小时观察到了明显的细胞荧光变化，如图5中C、D所示，说明PROTAC-4诱导了蛋白降解。仅加入FKBP12抑制剂AP21998和结合VHL的多聚精氨酸7肽的前后2.5小时，细胞荧光也没有变化，如图5中E、F所示。紧接着，加入PROTAC-4，前后2.5小时荧光也没有显著变化，说明AP21998和7肽与PROTAC-4有竞争性，如图5中E、F所示。蛋白质印迹分析显示，与仅用DMSO处理的细胞相比，加入PROTAC-4后2.5小时的EGFP-FKBP12（F36V）显著消除，如图5中K所示。

图5 DMSO、Protac-4、AP21998和多聚精氨酸7肽细胞内蛋白降解试验结果

对于PROTAC-5的细胞内降解试验，他们仍旧使用稳定表达绿色荧光蛋白（GFP）的HEK293细胞，通过细胞内荧光的损失来监测AR的蛋白水解。仅加入DMSO的细胞荧光1小时候未变暗，而加入50、100uM的PROTAC-5后1小时荧光明显消失。仅加入环氧酶素（epoxomicin）和加入环氧酶素+PROTAC-5的细胞，1小时候荧光没有消失，仅加入PROTAC-5的细胞荧光消失，如图6（D、E、F、J、K、L）。显微光场观察到的细胞密度变化说明了PROTAC-5可使细胞数量减少，如图6（A、B、C、G、H、I），环氧酶素对于细胞数量的减少是因为其本身对细胞的毒性而非蛋白酶体抑制。蛋白质印迹试验验证了PROTAC-5通过蛋白酶体途径降解GFP-AR。

图6 Protac-5通过蛋白酶体途径降解细胞内AR

在另外一个细胞试验中，研究人员分别对空白试验（图7A）、加入等体积DMSO（图7B）、25uM的PTOTAC-3（图7C）、25uM的PTOTAC-5和10倍过量睾酮（图7D）、25uM的PTOTAC-5和10倍过量多聚精氨酸7肽（图7E）、25uM的多聚精氨酸7肽和睾酮（图7F）、25uM的DHT（图7G）和多聚精氨酸7肽（图7H）细胞荧光的变化进行了比较。只有仅加入PROTAC-3的细胞荧光完全猝灭。也证实了，DHT、睾酮、多聚精氨酸7肽与PROTAC-5竞争性结合AR和VHL，从而阻断荧光猝灭。

图7 Protac与AR、VHL抑制剂等的对比细胞荧光试验

下一周，将和大家分享利用MDM2泛素降解雄激素（AR）的第一个“整体小分子”的PROTAC的设计，敬请关注分迪科技微信公众号。

参考文献

1. Schneekloth,J. S., Jr.; Fonseca, F. N.; Koldobskiy, M.; Mandal, A.; Deshaies, R.;Sakamoto, K.; Crews, C. M., Chemical genetic control of proteinlevels: selective in vivo targeted degradation. J Am Chem Soc 2004,126(12),3748-54.

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