《自然》快速评审：“基因魔剪”家族添新成员

► 加州大学伯克利分校的分子生物学家Jennifer Doudna是最早发现CRISPR-Cas9的科学家之一。Credit：Cailey Conner，加州大学伯克利分校

撰文 | 赵政东 （上海科技大学博士研究生、《知识分子》编译小组成员）

责编 | 尹宁 陈晓雪

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“基因魔剪”CRISPR-Cas系统因其操作简便、靶向精准等特点已经成为全球各大实验流行的基因编辑技术。12月23日凌晨，《自然》（Nature）在线发表一项研究“来自非培养微生物的新的CRISPR-Cas系统”（New CRISPR-Cas systems from uncultivated microbes），报告了两种新的CRISPR-Cas基因编辑系统：CRISPR–CasX 和CRISPR–CasY。这项发现来自于加州大学伯克利分校地质微生物学家吉利安·班菲尔德（Jillian F. Banfield）和分子生物学家詹妮弗·杜德纳（Jennifer Doudna）两个实验室的联合研究。

詹妮弗·杜德纳是最先发现CRISPR-Cas这一技术的科学家之一，但CRISPR-Cas的专利归属一直存在争议。值得注意的是，针对此次论文中的最新发现，詹妮弗等人已向美国专利及商标局提交了临时专利（provisional patent）申请。临时专利申请是在最后或完全的申请完成前向专利局递交的一种临时或过渡申请。其规定所针对的对象主要是已经脱离基础理论阶段，具有应用前景和潜在商业价值，但还不能申请专利的成果。如果一项成果的应用前景还不明朗，可以先申请临时专利，待进一步研究后再申请正式专利。

► 吉利安·班菲尔德（Jillian F. Banfield）在科罗拉多采集数据，CRISPR-CasX系统便发现于她采集到的细菌中，Roy Kaltschmidt 于2014年拍摄，来源：berkeley.edu

CRISPR–Cas系统中的核心成员之一是Cas (即CRISPR associated protein)，它是一种切割DNA的酶，是“基因魔剪”中的剪刀。

► 介导的系统定向基因组修饰作用机制示意图。Cas9内切酶是一种DNA内切酶，很多细菌都可以表达这种蛋白，Cas9内切酶能 够为细菌提供一种防御机制，避免病毒或者质粒等外源DNA的侵入。 利用Cas9内切 酶家族来靶标和剪切外源DNA的II型CRISPR/Cas免疫系统来进行有效的靶向酶切。 Cas9内切酶必须在向导RNA分子的引导下对DNA进行切割，这是因为这些向导RNA 分子含有与靶DNA序列互补的序列，称之为PAM序列。 Cas9内切酶在向导RNA分子 的引导下对特定位点的DNA进行切割，形成双链DNA缺口，然后细胞会借助同源重 组机制(homologous recombination)或者非同源末端连接机制(non-homologous end joining)对断裂的DNA进行修复。如果细胞通过同源重组机制进行修复，会用另外一 段DNA片段填补断裂的DNA缺口，因而会引入一段新的“遗传信息”，从而实现基因的编辑。图片选自上海南方模式生物研究中心。图片原始来源：http://www.nature.com/nature/journal/v495/n7439/full/495050a.html

目前人们在细菌中发现了很多Cas酶，其中最常用的来自酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes）。不同来源的Cas酶，其特性也不尽相同，虽然目前的CRISPR-Cas系统已相当成熟而强大，但是人们还是希望找到更多的Cas酶，以发掘更多的应用潜力：如寻找更小的Cas酶，因为现在使用的Cas酶是较大的蛋白，将其转入细胞中较为困难；再比如，Cas酶的作用需要依赖PAM（protospacer adjacent motif）的短DNA 序列，如酿脓链球菌中的Cas9酶需要识别的序列是NGG等，这在一定程度上会限制Cas9的基因编辑范围，而发现更多的Cas酶，则意味着可以识别更多的PAM序列，扩展基因编辑的范围。

我们知道Cas酶来自于细菌，而人类真正培养和认识的细菌非常有限，还有更多的细菌在我们生活的环境中，不为人所知。因此，研究人员决定直接从地下水、土壤、婴儿肠道、酸性矿坑水等富含各种微生物的环境中取材，虽然研究者们不能培养这些微生物，但是却可以获得它们的宏基因组信息，将这T数量级（terabase-scale）的宏基因组信息与CRISPR和Cas1序列进行类比。功夫不负有心人，研究者们发现了两类新型的CRISPR–Cas系统，并将其命名为CRISPR–CasX 和CRISPR–CasY，其中CasX蛋白约有980个氨基酸、CasY蛋白约有1200个氨基酸，它们是目前已知最小的CRISPR–Cas系统，因此具有巨大的基因编辑潜力。

随后，研究者们在大肠杆菌（）中对这两类CRISPR–Cas系统进行了功能检测，发现他们在特定的tracr gRNA的引导下，均可以与目标DNA相互作用。但是，研究者没有进行更深入的DNA切割、哺乳动物细胞等验证。

此外，研究人员还在古菌域中首次发现了Cas9。而过去学术界一直认为古细菌没有此类基因编辑系统，这大大更新了人们对这一系统的认识。

► 采集加利福尼亚州Crystal Geyser深层地下水中的微生物，CRISPR-CasY系统就是在这里发现，Jill Banfield 拍摄，来源：berkeley.edu

以CRISPR-Cas系统为代表的基因编辑技术可以实现对DNA片段的敲除、加入等，现在，以及可预计的未来，在生命科学基础研究、基因治疗等医学领域将有极大的应用潜力。因此，围绕CRISPR-Cas系统的专利争夺的也非常激烈。

2012年6月28日，詹妮弗·杜德纳实验室在《科学》（Science）在线发表论文，报告利用CRISPR-Cas9系统在体外实验中，实现了对DNA序列的编辑； 2013年1月29日，杜德纳实验室将这一技术成功应用在人类细胞中的论文发表在Elife上。而美国麻省理工学院博德研究所的张锋实验室已将这一系统应用在人类细胞上的研究论文，并在2013年1月3日在线发表于《科学》。通过缴纳专利快速审核费用，张锋率先拿到了CRISPR-Cas9系统应用于哺乳动物细胞的专利。加州大学伯克利分校后提起诉讼，以争夺这一专利的归属权。目前，美国专利商标局尚未做出最终裁决。

（致谢：感谢陆宗阳对文章内容的讨论）

参考资料：

1. New CRISPR–Cas systems from uncultivated microbes. Nature (2016).     doi:10.1038/nature21059

2. Marraffini L A. The CRISPR-Cas system of Streptococcus pyogenes: function and applications[J]. 2016.

3. Compact CRISPR systems found in some of world’s smallest microbes：http://news.berkeley.edu/2016/12/22/compact-crispr-systems-found-in-some-of-worlds-smallest-microbes/

4. 基因魔剪专利之争现新变数？杜德纳发现新“剪刀”并申请专利：http://www.thepaper.cn/newsDetail_forward_1585675

5. Biotechnology: Rewriting a genome：http://www.nature.com/nature/journal/v495/n7439/full/495050a.html

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