研究心脏腔室特异性基因调控新工具：优化的AAV特异性表达载体

实验动物模型体内，缺乏在心房和心室肌细胞中特异性表达特定基因的方法，限制了人们对心房颤动(美国最常见的心律失常)等病理性腔室特异性效应的了解。理论上，腺相关病毒血清型9(AAV9)可以通过基因工程的方法将其启动子活性修饰为心房或心室特异性的；然而，一个主要的限制是在病毒基因组中插入启动子和目的基因序列的序列有限，插入序列过大，超出或接近病毒包装容量，病毒的产生和传导率就会受到损害。因此，研究人员的目标是开发新的AAV启动子，最小化启动子长度使AAV载体可以容纳的目的基因长度最大化，同时赋予目的基因在健康或患病心脏中的心室心房组织特异性表达。相关研究成果以“Optimizing Adeno-Associated Virus Serotype 9 for Studies of Cardiac Chamber–Specific Gene Regulation”为题，近日发表在《Circulation》杂志上（IF=23.603）。

起初，研究人员分析了一些潜在的心脏腔室组织特异性表达基因后，选择了NPPA和Myl2调控心房肌细胞和心室肌细胞基因特异性表达的启动子。这些启动子在各个年龄段的健康小鼠中都具有明显的心脏腔室特异性基因表达活性，早期体内研究发现，NPPA启动子-425核苷酸到+25核苷酸区段和Myl2启动子的-226核苷酸到+36核苷酸区段是其表现出预期基因特异性的最短片段区域。

为了进一步研究这些启动子的心脏腔室特异性活性，研究人员采用Cre重组酶（Cre）双荧光报告基因小鼠（mT / mG）作为实验动物，转基因包含CAG启动子及其下游的Tomato（一种红色荧光蛋白）和GFP基因，示意图见图A。因此，每个mT / mG小鼠细胞都是Tomato阳性的，直到Cre基因导入表达的Cre酶切除位于Tomato开放阅读框侧翼的loxP位点，切除Tomato基因后会激活GFP表达（见图A）。

将最小的Nppa和Myl2启动子相应区段插入表达Cre的AAV9载体中，分别产生AAV9-A或AAV9-V。使用Tnnt2启动子作为在心房和心室肌细胞中均表达Cre的阳性对照（AAV9-P）（见图B） 。使用具有Myl2启动子且下游不含Cre基因的AAV9作为阴性对照，该启动子与AAV9-V中的启动子Myl2启动子序列不同（详见文献doi: 10.1161/CIRCRESAHA.118.313854的介绍）。通过尾静脉注射将AAV9以1E11vg/只的剂量注射到8周龄的mT/ mG转基因小鼠中。给药后两周，通过免疫印迹和共聚焦荧光显微镜对心房和心室组织进行分析，以间接检测AAV9介导的Cre表达，而通过QPCR技术直接测量Cre的表达。

结果符合预期，AAV9-N实验组，未见EGFP表达；AAV9-P实验组，EGFP明显表达；AAV9-A和AAV9-V实验组分别表现出明显的心房和心室GFP表达（见图C、图D）。相应的，AAV9-N实验组样本未检测到Cre mRNA表达；AAV9-P实验组的心房和心室样本中检测到了Cre mRNA表达；AAV9-A和AAV9-V分别在其心房和心室样本中检出了显着的Cre 表达的上调（见图E、图F）。

进一步实验确认了AAV9-A和AAV9-V的心脏腔室特异性是确实是与肌细胞特异性表达相关的（见图G），且上述AAV9载体的表达模式在心脏腔室病理学中未显改变（见图H）。

上述AAV9基因特异性表达载体被应用在心室心房中进行基因特异性表达研究，促进人们对心脏病的了解，有助于心脏病基因疗法的开发。

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