基因编辑进入迷你时代

前言

CRISPR-Cas作为一种新兴的基因编辑系统，已在基因表达调控、致病基因筛查和遗传病治疗等领域展现了巨大的应用前景。CRISPR-Cas系统主要包含 Cas基因和CRISPR基因座，CRISPR基因座由前导序列、重复-间隔序列和回文重复序列组成。前导序列负责将重复-间隔序列和回文重复序列转录形成pre-crRNA，pre-crRNA成熟后可形成crRNA。crRNA可通过核酸互补，引导Cas蛋白到目标核苷酸序列，实现精准切割。根据CRISPR-Cas作用模块的数量和种类， CRISPR-Cas系统被分为两类。第一类CRISPR-Cas系统包括类型I、III、IV，由多蛋白效应复合物与crRNA组成，而第2类CRISPR-Cas系统包括类型II、V和VI，为单一蛋白效应器。目前常用的DNA或RNA编辑器,如Cas9, Cas12和Cas13则分属第2类系统中的类型II、V和VI, 并通过不同的作用机制切割目的片段（图1和图2）。由于常用的Cas9, Cas12a和Cas13a大小接近4kb, 而用于递送基因编辑器到体内的AAV系统的包装上限约为4.7kb，因此寻找更小的基因编辑系统对于其高效体内递送具有重要意义。本文将对近年来有关迷你基因编辑系统的研究进展做简要梳理。

1. Cas9

II 型 CRISPR 系统根据 Cas9 蛋白之间的同源性程度等可细分为type II-A（包括SpCas9和SaCas9）、type II-B和type II-C三个亚型。来源于化脓性链球菌的SpCas9，基因编辑范围广、活性高，但其核苷酸序列长度为4.1kb，包装进入AAV困难，因此用于基因治疗较为困难。尽管来自金黄色酿脓葡萄球菌中的SaCas9大小为3.1kb, 但其识别的目标DNA序列中需要一个较长的NNGRRT PAM序列，因此限制了其编辑范围。针对该问题，王永明课题组2021年4月开发出SlugCas9-HF，大小与SaCas9相当，特异性比SaCas9和SpCas9都高，识别NNGG PAM，编辑范围与SpCas9一样大^[1]；2021年12月该课题组又开发出SchCas9，识别更简单的NNGR（R=A or G） PAM，编辑范围在原来的基础上又翻了一倍^[2]。

Type II-C Cas9如NmeCas9, Nme2Cas9, CjCas9, GeoCas9, BlatCas9和 PpCas9等其大小较SpCas9小，但由于Type II-C 较type II-A Cas9活性降低或其靶基因识别也需要一段较长的PAM序列，因此研究人员依然在构建新的Type II-C Cas9系统，使其具有较高核酸酶活性和较短的PAM序列^[3]。2022年8月，王永明课题组Elife文章展示其开发的 Nsp2-SmuCas9嵌合体，长度约为1000 氨基酸, 可识别N4C PAM，是目前最简单的PAM Type II-C Cas9系统^[3]；但其编辑活性扔有待提升。

图1 Cas9、Cas12和Cas13比较^[4]

图2. 第2类CRISPR-Cas系统分类^[5]

2. Cas12

与Cas9不同, Cas12系统识别的PAM在靶序列5’端，并以T和C为主, Cas12识别目标双链DNA并切割产生粘性末端。Cas9在识别gRNA中7、 8个碱基后，就开始与目标DNA结合；而Cas12在与目标DNA完全结合之前需结合18个碱基，此过程中若存在碱基无法配对，Cas12将与目标DNA脱离。因此，研究认为Cas12的特异性普遍较Cas9高。最常用的Cas12a变体自氨基酸球菌属（asCas12a）和鞭毛藻科细菌（LbCas12a），不需要tracrRNA，在基因编辑中得到较多应用。asCas12a和LbCas12a大小与SpCas9相当，因此也不便于AAV包装。基于此，李伟课题组和张锋课题组相继开发了AaCas12b和BhCas12b，大小为1100多个氨基酸，降低了活性Cas13蛋白的大小^{[6, 7]}。2018年Doudna课题组发现Cas14(又称Cas12f1,~500 氨基酸)，可介导单链DNA切割^[8]，随后该课题组于2019和2020年又分别开发了DpbCas12e（~1000氨基酸）和Cas12j（又称CasΦ， 700氨基酸）^{[9, 10]}。2021年Yong-Sam Kim、季泉江和亓磊组相继开发Un1Cas12f1（537 氨基酸），AsCas12f1（422 氨基酸）和SpaCas12f1 （497氨基酸），和CasMINI （源自Un1Cas12f1，529氨基酸）^[11-14]。Cas12f 核酸酶作为最紧凑的 CRISPR核酸酶，其大小仅为传统 Cas9  和Cas12a 核酸酶的一半，然而2022年胡家志课题组通过比较发现Un1Cas12f1, CasMINI和 AsCas12f1等新型Cas12f核酸酶的编辑活性普遍较Cas9或Cas12a低，而AsCas12f1在大多数编辑位点活性普遍较差^[15]。因此Cas12f需要继续提高其编辑活性，以推动迷你编辑器在基因定点突变、外源DNA插入等领域中的广泛应用。除此之外，2022年11月杨辉课题组在Protein & Cell 期刊发表了其最新的Cas12编辑器-hfCas12Max（~1000氨基酸），hfCas12Max 识别5’-TN 或5’-TNN PAM 序列，并在检测的目标序列中展现出优于SpCas9和LbCas12a的切割活性，且脱靶率较低，因此具有潜在的应用前景^[16]。

3. Cas13

Cas13蛋白属于2类VI型 CRISPR-Cas 系统，至少包括 Cas13a（1250氨基酸）、Cas13b（1150氨基酸）、Cas13c（1120氨基酸） 和 Cas13d四种亚型^[17]。与Cas12-crRNA复合物靶向双链DNA不同，Cas13 和crRNA组装形成一个由60~ 66 nt crRNA引导的RNA 靶向效应复合物。crRNA包括一个促进与相应Cas13蛋白酶结合的直接重复（Direct repeat，DR）序列以及一个特异性靶向RNA的间隔序列。Cas13a、c和d的DR序列在5’端, 而Cas13b的DR序列在3’端。与Cas9和Cas12依赖PAM识别靶序列不同，Cas13 需要靶序列侧翼存在PFS序列，但 PFS 对 Cas13 核酸酶活性不是必需的^[18]。

2021年张峰课题组发现Cas13b家族成员中的Cas13bt（~800氨基酸）同样可介导RNA编辑^[19]，同年杨辉课题组鉴定到两个新的Cas13家族成员，并命名为Cas13X（775氨基酸）和Cas13Y（790氨基酸），尽管通过改造获得的Cas13X.1切割活性较Cas13a和Cas13b低，但展现出与Cas13d类似的切割活性和特异性^[20]。2022年杨辉课题组通过蛋白质工程等手段开发出Cas13X的升级版-hfCas13X，显著降低了Cas13X的旁切活性，增强了其对RNA编辑的高保真性^[21]。

4. IscB和TnpB

2021年张峰课题组在Science发文，通过使用进化分析、RNA 测序和生化实验，在 IS200/IS605 转座子重建了 CRISPR-Cas9 系统的进化过程，发现IscB/IsrB 可用RNA介导双链 DNA的切割，并用于人类细胞的基因组编辑。另外，该课题组还在IS200/IS605 转座子上发现了另一个蛋白TnpB，同样具有RNA 引导的核酸酶活性^[22]。IscB和 TnpB 可能分别是Cas9和Cas12的祖先， 而IsrB可能是IscB的前身。IsrB 大小约为350氨基酸，IscB大小约为400氨基酸，TnpB大小约为550氨基酸，可在ωRNA的引导下切割目的DNA。ωRNA大小为200-400nt的非编码RNA, 明显较Cas9（~100nt）和Cas12 (~40nt) 的向导RNA序列长度多。由于IscB和IsrB大小仅为SpCas9的五分之二，因此它们可能与胞嘧啶脱氨酶（APOBEC）、腺苷脱氨酶（TadA）或逆转录酶（RT）形成融合蛋白，以一种较小的蛋白复合物形式发挥胞嘧啶碱基编辑器（CBE）、腺苷酸编辑器（ABE）或先导编辑器（PE）的类似功能。基于IscB和IsrB的上述基因定点编辑系统，其大小有望限制在AAV包装的上限（约为4.7kb），因此具有极大的临床应用价值。

Cas9 拥有HNH 和 RuvC两个核酸酶活性结构域，而 Cas12只有一个 RuvC 核酸酶活性结构域，但两者都具有一个可结合引导RNA的α-螺旋识别结构域（REC）。IscB保留了与Cas9相同的RucV和HNH结构域，而IsrB在IscB的基础上进一步缺失HNH结构域，因此尺寸更小。IscB和IsrB都利用ωRNA对靶序列进行识别，较长的ωRNA序列通过形成复杂三维结构起到Cas9和Cas12 中REC结构域的作用^{[23, 24]}。

5. 迷你Cas临床前进展

目前基于Crispr-Cas系统的临床或临床前研究依然依赖于与SpCas9和Cas12a，由于其分子过大，一般采用双AAV载体或非病毒载体（如脂质纳米颗粒）递送体内；但上述方法将降低基因编辑器的体内递送效率。因此开发迷你基因编辑系统使其能被单AAV载体包装，对提高体内递送效率具有重要意义。2021年由杨辉教授创建的辉大公司宣布其自主研发的Cas13X和Cas13Y的底层专利正式获美国专利局授予专利权，并与2022年获得数亿元的C轮融资，以加速迷你型RNA编辑器-Cas13X和Cas13Y 相关的技术研发及临床研究。2022年由斯坦福大学亓磊教授创立的Epic Bio公司宣布获得A轮5500美金融资，用于探索其构建的迷你型DNA编辑器CasMINI在治疗人遗传病中的应用潜力。

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参考资料：

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E.N.D

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