科研 | Glob Chall：研究者发现与未来2型糖尿病风险和易感基因相关的新代谢物（国人佳作）

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编译：微科盟孙元元，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。

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导读
在一个中国前瞻性队列中，我们选择500例在随访4.61年内新发的2型糖尿病(T2D)患者和500例匹配的健康受试者作为病例组和对照组，随机分为发现组和验证组，以发现T2D发病前的代谢物变化及其相关的糖尿病基因。血清代谢组学分析显示81种代谢物在T2D发病前发生了显著变化。我们基于二元Logistic回归分析8种代谢物被定义为T2D预测的生物标志物组合。吡哌啶酸、肉碱C14:0、肾上腺素和磷脂酰乙醇胺34:2首次被发现与T2D预测相关。我们将8种生物标记物添加到临床标记物(BMI、甘油三酯和空腹血糖)中，分别显著提高了发现集和验证集的预测能力。我们将代谢组学与基因组学相结合，发现二十碳四烯酸与FADS1基因(rs174559)显著相关(p<5.0×10⁻⁸)，并发现吡啶甲酸与CHRM3(rs535514)、亮氨酸/异亮氨酸与WWOX(rs72487966)之间存在显著的相关性(p<5.0×10⁻⁶)。亮氨酸/异亮氨酸水平升高增加了T2D的风险。综上所述，我们在T2D发病前观察到了多种代谢紊乱，新的生物标志物群有助于预测T2D风险。

论文ID

原名：Metabolome-Genome-Wide Association Study (mGWAS) Reveals Novel Metabolites Associated with Future Type 2 Diabetes Risk and Susceptibility Loci in a Case-Control Study in a Chinese Prospective Cohort译名：在一项中国前瞻性队列病例对照研究中代谢组-全基因组关联分析发现与未来2型糖尿病风险和易感基因相关的新代谢物
期刊：Global Challenges
IF：4.306发表时间：2021.03通讯作者：许国旺&邬堂春
通讯作者单位：中国科学院大连化学物理研究所&华中科技大学同济医学院

实验设计

实验结果

1. 参与者的基线特征

本研究对发现集和验证集中的病例组和对照组的基线特征都进行了比较(表1)。如表1所示，病例组和对照组在年龄、性别、吸烟状况、饮酒状况或体力活动方面没有显著差异。病例组的体重指数(BMI)、收缩压(SBP)、舒张压(DBP)、甘油三酯(TG)水平和空腹血糖(FG)水平显著高于对照组，而高密度脂蛋白胆固醇(HDL)水平低于对照组(P<0.05, FDR<0.1)。我们通过Cox回归计算临床参数每标准差(SD)增量的优势比(OR)。对于差异显著的临床参数，T2D的风险与基线BMI、SBP、DBP、TG、Fg水平显著正相关，与HDL水平显著负相关。在验证队列中，病例组参与者的体重指数、甘油三酯和纤维蛋白原水平显著高于对照组，并且这些参数与T2D的风险显著正相关。

表1 发现集和验证集中参与者的基线特征

2. 与T2D发病相关的代谢物和代谢途径显著改变

以液相色谱-质谱(LC-MS)为基础的代谢组学方法我们对发现组的血清样本进行分析。基于内部数据库，我们总共鉴定了206种代谢物。在这些已鉴定的代谢物中，94.7%的代谢物在发现集的质量控制(QC)样本之间的相对标准偏差(RSD)值小于30%。这些代谢物可用于后续数据分析。非参数检验用于发现显著改变的代谢物。图1A显示了81种差异显著的代谢物的变化(P<0.05, FDR<0.1)。为了研究不同代谢物与未来T2D风险之间的关系，我们计算了每SD增量的OR值(图1B)。我们使用匹配因素(年龄、性别)、肥胖(BMI)和生活方式因素(吸烟、饮酒和体力活动)对OR值进行调整得到了多变量调整后的OR值。如图1A、B所示，在T2D发生前酰肉碱、支链氨基酸、芳香族氨基酸、游离脂肪酸(FFAs)、磷脂酰胆碱(PC)和磷脂酰乙醇胺(PES)水平显著升高，且这些代谢物与未来T2D的风险呈显著正相关(OR值>1)。另一方面，大多数溶血磷脂酰乙醇胺(LPEs)和溶血磷脂酰胆碱(LPCs)水平降低，且与未来T2D的风险呈显著负相关(OR值<1)。此外，基于显著变化的代谢物的途径分析结果如图1C所示。在T2D发生前，氨基酰-tRNA的生物合成(p<0.001，FDR=0.002)和不饱和脂肪酸的生物合成(p<0.001，FDR=0.002)是最显著变化的代谢途径。

3. 用于T2D预测的未来风险相关代谢物和代谢标记物

为了区分对照组和病例组，我们对发现集中病例组和对照组之间有显著差异的81种代谢物进行了二元Logistic回归。我们建立了由哌啶甲酸、1,5-脱水-D-葡糖醇、LPC 18:2、肉碱C14:0、亮氨酸/异亮氨酸、二十碳四烯酸(FFA 20:4)、肾上腺素和PE 34:2等8种代谢物组成的联合代谢生物标志物组合。为方便起见，我们将其命名为联合代谢物生物标志物(CMB)。这8种代谢物的变化趋势显示在图1A中，ORs的分布显示在图1B中。与对照组相比，病例组肉碱C14:0、亮氨酸/异亮氨酸、游离脂肪酸20:4、肾上腺素、PE34:2水平升高，而且它们的基线水平与T2D发病风险呈显著正相关。此外，在T2D发病前，吡啶甲酸、1,5-脱水-D-葡糖醇和LPC 18:2水平降低，而且它们的基线水平与T2D发病风险呈负相关。

此外，我们还对发现组中显著不同的临床参数进行了二元Logistic回归。体重指数(BMI)、甘油三酯(TG)和纤维蛋白原(Fg)被定义为临床生物标志物组合(CCB)。对于预测T2D，CCB的OR值为3.028(95% CI为2.332–3.933, p < 0.001)、CMB的OR值为2.243(95%CI为1.808~2.782，p<0.001)，CCB+CMB的OR值为3.445(95%CI为2.604~4.558，p<0.001)(图1D)。CMB和CCB的受试者工作特征曲线(AUC)下面积分别为0.708和0.755，在CCB中加入CMB显著提高了预测能力(Auc=0.773，p=0.031)(图1E)。

我们为了验证这三个预测模型，使用208对病例和匹配的对照样本作为验证集，验证集中的血清样本采用相同的基于LC-MS的代谢组学方法进行分析，206种已鉴定代谢物中有89.8%在质控样本中的RSD值小于30%。CMB、CCB及其联合应用的OR值分别为1.832(95%CI为1.475~2.276，p<0.001)、2.742(95%CI为2.090~3.599，p<0.001)和3.150(95%CI为2.338~4.244，p<0.001) (图1D)。CMB和CCB的AUC分别为0.687和0.772(图1F)，在CCB中加入CMB显著提高了预测能力(AUC=0.797，p=0.017)。

图1 A，发现组中p值小于0.05且FDR值小于0.1的显著变化的代谢物的散点图，圆圈的直径表示代谢物变化的程度。在病例组中，显著改变的代谢物随着水平的升高以红色标记。病例组中水平降低的显著变化的代谢物以绿色标记；B,发现组中的代谢物和糖尿病风险发生了显著变化。图中显示了每SD增量未调整的OR值和每SD增量的多变量调整OR值(*：P<0.05；**：P<0.01)。多变量调整OR值是根据年龄、性别、BMI、吸烟状况、饮酒状况和体力活动进行调整得到的；C，基于糖尿病发病前显著变化的代谢物的通路分析；D，T2D的预测模型得分每SD增量的ORs；E，发现集的ROC曲线；F，验证集的ROC曲线。

4. 易感基因与因果关系

在上述研究的基础上，我们对基线时显著变化的代谢物和SNPs进行了mGWAS，以寻找与T2D事件相关的潜在位点。图2显示了FFA 20:4的GWAS结果。图2A是Manhatten图，显示了每条染色体上的位点与FFA 20:4之间的相关性。我们发现有13个位点与FFA 20:4相关。Manhatten图(图2B)显示FFA 20:4与11号染色体的关联主要由rs174559驱动(p=2.3×10⁻¹⁰)。rs174559位于FADS1(脂肪酸去饱和酶1)基因区域。rs174559位点的等位基因为G和A，其中A为主等位基因，G为次等位基因(次要等位基因频率(MAF)=0.39)，次要等位基因与游离脂肪酸20：4水平升高相关(β=0.206)。

图2还显示了吡啶甲酸和亮氨酸/异亮氨酸的GWAS结果。1号染色体上的rs535514位于胆碱能受体M受体3(CHRM3)基因区域，该基因与胰岛素分泌有关。如图2D所示，rs535514的等位基因C与哌啶甲酸水平升高有关(p=5.4×10⁻⁷，β=0.157，MAF=0.42)。rs72487966(16号染色体上的SNP)位于氧化还原酶(WWOX)基因的WW区域，是T2D的危险基因。如图2F所示，rs72487966的等位基因G与亮氨酸/异亮氨酸水平升高相关(p=2.92×10−6，β=0.411，MAF=0.03)。我们还试图进行两样本孟德尔随机化(MR)分析，以评估哌啶甲酸或亮氨酸/异亮氨酸与T2D之间是否存在因果关系。基于东风-同济队列的汇总统计meta分析结果以及KORA队列和Twins UK队列的公开结果，我们对亮氨酸/异亮氨酸水平进行了双样本MR分析。结果表明亮氨酸/异亮氨酸与T2D之间存在因果关系(OR=0.004，95%CI为1.001~1.006，p=0.001)。

图2 与他汀类药物治疗相关的粪便微生物组成的改变
A，FFA 20:4的Manhatten图；B，FADS1基因附近与FFA 20:4相关的SNPs的LD(r²)和p值的区域图；C，哌啶甲酸的Manhatten图；D，CHRM3基因附近与哌啶甲酸相关的SNPs的LD(r²)和p值的区域图；E，亮氨酸/异亮氨酸的Manhatten图；F，哌啶甲酸的Manhatten图；D，WWOX基因附近与亮氨酸/异亮氨酸相关的SNPs的LD(r²)和p值的区域图。蓝线和红线分别表示建议的全基因组阈值(p<5.0×10⁻⁶)和显著的全基因组阈值(p<5.0×10⁻⁸)。

讨论

在这个嵌套的中国前瞻性队列中，我们进行了一种基于非靶向超高效液相色谱-质谱(UPLC-MS)的血清样本代谢谱分析，并与基因组学相结合。据我们所知，这是对中国非糖尿病患者进行的最全面的代谢组学研究之一，旨在揭示T2D发病前的重大代谢变化，并预测T2D发病风险。根据我们的结果，我们共鉴定出206种代谢物，其中肉碱、氨基酸、脂肪酸、有机酸、脂类等81种代谢物在T2D发病前均有明显变化。8种与T2D发病风险相关的代谢物被定义为T2D预测的CMB，其中4种代谢物(LPC18:2、1,5-脱水-D-葡糖醇、FFA 20:4和亮氨酸/异亮氨酸)在其他队列研究中有报道，并在我们的中国前瞻性队列研究中得到验证。在这项前瞻性队列研究中，我们首次报道其中4种(吡啶甲酸、肉碱C14：0、肾上腺素和PE34：2)与T2D发病风险显著相关。CMB在发现集和验证集的AUC分别为0.708和0.687，表明CMB对T2D的发生具有可接受的预测能力。CMB和CCB的组合显著提高了CCB的预测能力，发现集中的预测能力从0.755提高到0.773，验证集中的预测能力从0.772提高到0.797。

在本研究中，在T2D发作之前，病例组大多数LPEs和LPCs水平降低，而PC和PES水平升高(图1A)。LPCS和LPEs主要来源于磷脂酶A作用的PC和PE。据报道，糖尿病患者的磷脂水平发生了显著变化。本研究中这些磷脂的显著变化暗示，在T2D发病之前，磷脂代谢就出现了异常。值得一提的是，作为CMB的一员，在欧洲队列中发现较低水平的LPC18:2与T2D发病风险相关，这与我们在中国队列中的结果一致。此外，PE34:0首次被报道与T2D发病风险相关，并在我们的研究中被定义为判别标记。

游离脂肪酸是一种重要的能量物质，可以在肉碱的帮助下转移到线粒体进行β氧化。在我们的结果中，游离脂肪酸和酰肉碱水平在T2D发生前显著升高。多数游离脂肪酸与T2D的发展呈显著正相关，其中FFA 20:4和肉碱C14:0被我们定义为T2D的预测因子。根据已发表的研究，T2D患者的游离脂肪酸和酰基肉碱水平显著升高。FFA 20:4在法国的一个前瞻性队列中被报道与T2D发病呈正相关。在另一个中国T2D的前瞻性队列中，研究人员也分析了肉碱C14:0的基线特征，却没有发现病例组和对照组之间的显著差异，及其与T2D发病风险的显著关系。此外我们还计算了肉碱C14：0的比例和短链酰辅酶A脱氢酶(SCAD)的活性。SCAD是线粒体β氧化的起始反应—电子传递的限速酶。在本组病例中，肉碱C4:0/肉碱C3:0的比值显著升高(P<0.001)表明SCAD的活性降低。这一结果暗示我们在T2D发生之前，脂肪酸的β氧化可能已经受损。值得注意的是，据报道不完全脂肪酸β氧化可导致胰岛素抵抗，这在T2D的发病机制中起着重要作用。

此外，根据我们的mGWAS结果，与FFA 20:4最相关的SNP是rs174559(11号染色体上的SNP)，它位于FADS1基因区域(图2A，B)。另一些定位于FADS1基因的SNPs也被报道与FFA 20:4显著相关。FADS1编码不饱和脂肪酸代谢中的一个重要酶。本研究中的途径分析(图1C)显示在T2D开始之前，不饱和脂肪酸的生物合成存在显著的障碍。在日本的一项研究中，FADS1也被报道与T2D风险的增加有关。

在我们的研究中，病例组的哌啶甲酸降低，并且与T2D发病风险显著负相关。已有研究人员分析了地中海人群中T2D患者的吡哌甲酸基线特征，但他们未发现基线水平与T2D风险之间的显著关联(p>0.05)。本研究首次发现吡哌甲酸基线水平与T2D发病风险显著相关。此外，mGWAS结果显示rs535514与哌啶甲酸水平相关，rs535514位于CHRM3基因区域(图2D)。已有研究表明CHRM3基因编码的M型胆碱能受体3可干扰下丘脑调节食欲的控制。已有研究发现在皮马印第安人中CHRM3与T2D早期发生的风险有关，CHRM3是一种与刺激胰岛素分泌有关的基因。乙酰胆碱与M型胆碱能受体3一起调节胰岛素分泌，控制胰岛细胞增殖并维持血糖水平。

我们还发现病例组中血清氨基酸水平显著升高，并与T2D发病风险呈正相关，包括支链氨基酸(亮氨酸/异亮氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸和酪氨酸)、赖氨酸和甲硫氨酸。根据以往的研究，氨基酸代谢与T2D密切相关。例如，芳香族氨基酸和支链氨基酸被报道与胰岛素抵抗相关。此外，在日本的一个队列中，高含量的支链氨基酸被确认为糖尿病发生的危险因素，支链氨基酸也被选为未来糖尿病的预测因子。在我们的研究中，亮氨酸/异亮氨酸与T2D发病风险显著正相关，并被选为预测糖尿病发生的标志，这与前面提到的文章是一致的。根据mGWAS的结果，WWOX基因中的一个SNP(rs72487966)与亮氨酸/异亮氨酸相关(图2F)。WWOX基因与HOMA-β相关，可以调节葡萄糖代谢并且被认为是糖尿病的易感基因。此外，两个样本MR分析的结果显示亮氨酸/异亮氨酸与T2D之间的关系是因果的，并且亮氨酸/异亮氨酸浓度升高增加了T2D的风险，这已与其他已发表的队列研究相互证实。这表明这些产生亮氨酸/异亮氨酸的代谢途径紊乱可能导致T2D的发病。

据我们所知，本项研究首次报道了哌啶甲酸与CHRM3、亮氨酸/异亮氨酸与WWOX之间的相关性。这一新的关联可能为T2D的发病机制提供新的见解。然而这些相关性还需要更多的验证性研究来证明。

肾上腺素和1,5-脱水-D-葡糖醇是本研究中组成CMB的两种代谢物。肾上腺素可以增加内源性葡萄糖的产生。较低的1,5-脱水-D-葡糖醇水平已被临床用作血糖升高的标志。根据我们的结果，肾上腺素的显著增加和1,5-脱水-D-葡糖醇的显著降低在T2D发生之前就已经存在(图1)。中国上海的一项前瞻性研究报告已经报道1,5-脱水-D-葡糖醇与T2D发病风险呈负相关，然而本项研究首次报道了肾上腺素与T2D发病风险呈正相关。

然而，我们的研究也存在一定的局限性。参与者都是来自武汉的中国人，年龄相对较大，因此还需要更多的研究来验证我们的研究成果是否适用于其他年龄段和其他民族。此外，这项研究的结果应该在不同中心的队列中独立复制以进行验证。

综上所述，我们发现了在T2D发病前发生的代谢变化，以及可用于提前预测T2D发病的8种风险相关代谢物，其中的四种代谢物首次被报道与T2D发病风险有关。FADS1、CHRM3和WWOX基因与T2D相关代谢物相关。此外，亮氨酸/异亮氨酸水平升高与T2D发病风险增加之间的关系已被证明是有因果关系的。虽然还需要进一步的生物功能验证研究，但我们的发现补充了目前对糖尿病发病的理解，并可以为进一步的机制研究提供基础。

原文链接：  

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33854788/

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