荧光定量PCR的实验设计和体系优化
引物设计原则
SYBR Green I方法引物设计标准
引物长度17～25mers；
GC含量40%～60%；
一对引物的Tm不能相差太大，尽量避免超过2℃；
避免引物自身或一对引物之间形成4个或4个以上连续配对；
避免引物自身形成环状发卡结构；
引物的3'端碱基最好为G或C，尽量避免3'端碱基为T；
目的基因和内参基因所扩增的PCR产物长度尽量一致，不大于300bp，有利于使两种基因扩增效率相同。
TaqMan方法探针设计标准
探针应尽可能靠近扩增引物，但不能与引物重叠；
长度一般为18～40mer；
GC含量控制在40%～80%；
Tm值为70℃左右最为合适；
探针的5'端应避免使用G碱基，其会淬灭荧光，导致检测失败；
在整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量，因为G会降低扩增效率；
PCR产物长度最好在150bp以下；
探针的Tm要比引物高出5℃，以保证探针与模板结合的稳定程度大于引物与模板的结合。
Real-time PCR实验体系
反应体系：
| 物质 | 体积 |
|---|---|
| 2x SYBR Green I Mix | 10μL |
| 上下游引物（10μmol/L） | 0.4μL |
| Rox | 0.4μL |
| 模板 | 1～2μL |
| RNase-free水 | 至20μL |
Rox染料
在Real-time qPCR的反应过程中，由于不同反应孔中反应液体积的微量差别、qPCR管的内在差异、以及反应进行中的随机因素等，会导致不同反应孔的荧光信号出现差异，因此向每个反应孔中加入等量的Rox染料，其作用包括：
校正单次反应中由于泡沫或蒸发而导致的信号改变；
均一化校正由于移液物差导致的批内体积差异；
均一化校正批间体积差异，提供更连续一致的批间重复Ct值。
目前共有两种Rox被投入使用，不同型号的Real-time qPCR仪所用Rox各不相同，根据所有试剂的说明书选择准确的Rox，如果所加的Rox与仪器要求不符，则会导致Real-time qPCR实验的失败。
反应体系配制注意事项
Real-time qPCR的整个操作要在冰上进行，以防止PCR反应的提前开始和模板的降解。
除了模板外的反应体系统一配制，之后分别加入到8连管或96孔板中对应的反应孔中，配制时需要多配制3-5个反应所需体系，以防最后向反应孔中添加时不够。
添加模板时要注意枪头中的液体是否完全推净，并频繁更换枪头，以减少由于操作带来的误差。
每个样品对于每个目的基因同时进行3次重复的Real-time qPCR反应，同时还要进行以无菌水作为模板的阴性对照。
反应条件：
预变性：95℃，5min；
扩增：95℃，30s；55℃，30s；72℃，30s；40个循环；
熔解曲线：起始温度60℃，终止温度95℃，温度变化速率为0.1℃。
融解曲线
在SYBR Green I 染料法中用于确定PCR产物的特异性，当PCR反应结束时，从50℃一直加热到95℃，在此过程中PCR产物按照Tm值的大小双链被依次打开，荧光强度也随着双链的打开依次减弱，从而得到溶解曲线。
融解曲线为单峰则证明PCR反应没有出现非特异性产物。
实验方案的优化
Mg2+的浓度
Mg2+的浓度是影响Taq酶活性的关键因素，Mg2+浓度过低可影响Taq酶最佳活性的发挥，Mg2+浓度过高，会增加非特异性扩增。
一般来说，以DNA或cDNA为模板的Real-time qPCR反应，应选择2～5mmol/L的Mg2+浓度，以mRNA为模板直接进行的反应，应选择浓度为4～8mmol/L。
模板的质量和浓度
模板的浓度应根据Ct值进行选择，一般而言，使Ct值位于15～30个循环之间比较合适，若大于30则应使用较高的模板浓度，如果Ct值小于15，则应降低模板浓度，如果研究者是进行首次实验，那么应选择一系列稀释浓度的模板来进行实验，以选出最为合适的模板浓度。
PCR抑制
对于一些成分复杂样本（土壤、沉积物等）的Real-time qPCR反应，此时提取的DNA模板中通常含有较多的腐殖质等物质，其会抑制PCR反应，导致扩增效率下降，从而使对目的基因的定量准确性降低。
通常采用用对DNA模板进行稀释的方法消除PCR抑制，但是某些情况下，由于模板量较少，稀释的办法并不适合，就需要对模板进行额外的纯化。
引物浓度和纯度
引物浓度太低会致使反应不完全，若引物浓度太高，则发生错配，并产生非特异性的扩增产物。对于大多数PCR反应，0.5μmol/L是适宜的引物浓度，若初次实验结果并不理想，可在0.3～1.0μmol/L之间进行调整。
Real-Time qPCR所用引物的纯度至少要达到PAGE级，如使用OPC级引物会造成结果的不准确。
引物二聚体
通常目的基因PCR产物熔解曲线的峰出现在80～90℃之间，当熔解曲线在70～80℃范围内出现一个荧光强度较小的峰时，表明Real-time qPCR反应有引物二聚体生成。
此时首先要判断引物二聚体产生的原因，如果在高目的基因拷贝样品中没有出现引物二聚体，而只在低目的基因拷贝样品中存在引物二聚体，此时引物二聚体的出现是由于样品中目的基因含量过低，导致引物过量而发生自我匹配，可以通过增加模板使用量或减少引物使用量的方式消除引物二聚体。
另一种消除引物二聚体的方式是提高退火温度，但是并不是一定有效，建议在进行Real-time qPCR之前最好通过温度梯度PCR的方式检验引物是否会形成二聚体，同时确定合适的退火温度。
扩增效率
在绘制目的基因标准曲线时，经常会遇到扩增效率偏差较大的问题。
可以在反应体系中添加500μg/mL的BSA（牛血清蛋白），BSA能够稳定低浓度的核酸模板，同时提高扩增效率。
短的PCR产物比长的PCR产物扩增效率高，这是因为短的产物在95℃时更易变性，使引物和探针在退火阶段更有效地与其互补序列结合，降低来源于基因组扩增的污染，同时缩短了扩增时间。
提高退火温度可以提高PCR反应的特异性和扩增效率，必要时可以将退火温度提高至60℃以上，并去除72℃的延伸阶段，将退火和延伸合并为一个阶段进行，以保证目的基因的扩增效率。
如标准曲线的扩增效率高于100%较多，多数是由于标准品梯度稀释过程中操作失误，导致稀释倍数较多的低浓度标准品不准确，应重新对标准品进行稀释后再次绘制标准曲线。
基本分子生物学实验系列
核酸提取
核酸质量检测
目的基因PCR和克隆
荧光定量PCR
荧光定量PCR的实验设计和体系优化
荧光定量PCR的仪器设置