AET2018回顾：CDC技术篇

编者按：本系列报道由“华人抗体”公众号和“礼来亚洲资本”公众号同步推送。 这是第二篇。下面是第一篇的链接：

相关报告：

Imaging Complement by Phase-plate Cryo-electron Tomography from Initiation to Pore Formation

Thom Sharp, Assistant Professor, Cell and Chemical Biology, Leiden University Medical Center, The Netherlands

12/12/2018 8:15

Antibody Interactions with Other Components of the Immune System

Paul W.H.I. Parren, Professor, Department of Immunohematology and Blood Transfusion, Leiden University Medical Center and EVP and Head of R&D, Lava Therapeutics, The Netherlands

12/09/2018 16:00

Complement Activation Alone Drives Efficacy of a Novel Anti-gonococcal Monoclonal Antibody

Sanjay Ram, Professor of Medicine, Division of Infectious Diseases and Immunology, University of Massachusetts Medical School

12/12/2018 8:45

单抗药在结合靶点后，往往会通过以下几种作用机理来阻止或改变疾病过程：

1.      Neutralization/Blocking: 占据靶向分子，不让它和别的分子结合。

2.      Signaling/Agonist: 激活受体分子，引起下游信号传导。

3.      Targeting/Antibody-Drug Conjugate (ADC): 抗体分子身上绑着“炸弹”（放射性同位素）或“匕首”（化疗药），识别并结合到肿瘤细胞表面的抗原后，会进入到细胞内部，继而释放武器，杀死肿瘤细胞。

4.      Apoptosis/Programmed Cell Death (PCD): 抗体分子结合细胞表面的靶点后，或引起抗原交联，或激活死亡受体，从而最终导致细胞自杀。

5.      Antibody-Dependent Cellular Phagocytosis (ADCP): 抗体分子结合细胞表面的抗原后，通过其Fc部分把巨噬细胞招来，巨噬细胞再把肿瘤细胞或病菌细胞吞噬。

6.      Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity (ADCC): 抗体分子结合细胞表面的抗原后，通过其Fc部分招来NK细胞，NK细胞再对肿瘤细胞或病菌细胞痛下杀手。

7.      Complement-Dependent Cytotoxicity (CDC): IgG抗体结合抗原后，每六个抗体分子在细胞表面形成雪花状的六聚体，启动补体级联反应，最终在细胞膜上打孔，引起细胞裂解。

一个“裸”抗体分子，除了无法使用上述的第三种“武器”， 有可能使用其它任何一种甚至多种武器。AET2018的这三个报告主要讲述了如何改造抗体，将第七种武器——CDC­——的威力发挥到极致。三个报告构成了一个近乎完美的故事：从科学到技术，再从技术到应用。而这个故事背后的主角是总部位于丹麦的生物技术公司Genmab。

科学

我们在设计单抗药时，往往选择在肿瘤细胞、病菌细胞或病原入侵细胞的表面上过量表达、而在正常细胞中几乎不表达的抗原作为靶点。 当IgG抗体的Fab部分结合到这些抗原后， 如果满足了一定的条件，这些IgG分子的Fc区域会相互作用、联结。当六个结合了抗原的IgG分子在细胞表面联结成一个环形的六聚体后， 这种美丽的“雪花”就成为该细胞的死亡之戳。 IgG的Fc上暴露出能结合C1q的位点。 C1q是补体系统的第一个蛋白成员，它有六只长臂(gC1q)，分别抓住六个Fc区，并同时携带着一对C1r和一对C1s蛋白酶（C1r2s2）。C1r和C1s开始引发一系列级联反应，其涉及的补体家族成员包括C4, C2, C3, C5, C6, C7, C8和C9。C5b、C6-C9再组装成膜攻击复合体（MAC）。最后MAC会在细胞膜上凿孔，引起细胞裂解。

在报告中，Sharp博士介绍了用冷冻电镜的手段观察到的IgG1-C1的三维结构。他们团队在脂质体表面或溶液中重建"抗原-抗体-补体"复合体，再用冷冻电镜监测其形成的动态过程，并通过使用一系列氨基酸置换的IgG1蛋白来找出对IgG1-C1q结合起到关键作用的氨基酸。 IgG1和C1q结合的位点主要在CH2区域。与抗体结合后，C1q的六只长臂缩紧, 引起C1r2s2酶的变构和C1q的锥形梗的倾斜，进一步激活C1s蛋白酶。IgM抗体分子会自然形成五聚体（95%）和六聚体（5%），其中IgM六聚体更容易诱导CDC。Sharp还对比了(IgM)₅-C1、(IgM)₆-C1和(IgG1)₆-C1在空间结构上的差别。

技术

Parren博士从2001年起在Genmab工作了16年，负责临床前研发。他是ofatumumab （ARZERRA）, daratumumab (Darzalex)和teprotumumab（临床2期）等几个单抗药的发明人之一。他带领的团队还建立了两个技术平台：DuoBody和HexaBody。2017年8月，Parren离开了Genmab。2018年5月，他加入了新创企业Lava Therapeutics, 主管新一代BiTE的开发工作。自2015年起，Parren还担任着Leiden University的全职教授。

上面提到的HexaBody平台的核心技术就是设计、改造抗体分子的Fc部分，从而加强CDC效应。在他的报告中，Parren博士讲述了HexaBody技术的建立过程。其理论基础是“雪花”六聚体的发现和IgG1的蛋白晶体结构。 将来，HexaBody技术的进一步改进可能会使用到Sharp的冷冻电镜数据（Sharp和Parren同为图1中引用的Science论文的通讯作者）。

Parren团队提出的假说是：任何帮助IgG1分子联结成环状六聚体的氨基酸突变都有可能帮助增强CDC效应。 他们通过定点突变建造了一系列Fc: Fc结合力被改变了的IgG蛋白，并用几个细胞系建立了CDC细胞分析手段， 再借此筛选出增强或抑制CDC的氨基酸置换。他们发现IgG1蛋白分子中从N端数第345个氨基酸和第430个氨基酸都非常重要。 处于这两个位置的氨基酸都是谷氨酸——E345和E430。IgG1天然蛋白的这两个谷氨酸实际上抑制了Fc之间的相互联结，从而抑制了“雪花”的形成和C1q 的招募。将它们任何一个更换成其它任何氨基酸都可以增加IgG1的 CDC功能，而且这种加强效应具有普适性：在多个抗体分子中引进了E345R（第345位的谷氨酸换成精氨酸）突变后，他们发现所有抗体的CDC功能都增加了至少10倍。

但具有E345R的单抗分子成药性并不强：它们的聚合能力太强，在溶液中就形成六聚体。理想中的以CDC为主要武器的单抗分子应该具有以下几个特性：

1.      只有在结合了抗原后，才在细胞表面形成雪花六聚体，而不会在溶液中或没有结合抗原时就聚合。

2.      不影响抗体分子的其它武器的威力，比如细胞自杀效应。

3.    不影响单抗分子的成药性（developability）和可生产性(manufacturability)。

Genmab团队又接着针对345和430两个位置产生了一系列IgG1突变蛋白，再经过多轮筛选后，挑拣出E345K和E430G两个突变。它们每个都可以赋予抗体分子超强的诱发CDC的能力，又不影响其生物物理特性。HexaBody技术平台就此诞生。

应用

淋病是由淋球菌 （N. gonorrhoeae）引起的一种性传染病。在过去，使用青霉素等抗生素就可以治愈淋病。但现在对抗生素有耐药性的病例数急速上升。淋球菌已经进化成一种超级病菌。 除了开发新的抗生素外，我们迫切需要新的治疗手段。 Ram博士和他的合作者就致力于这一领域。

Ram在他的报告中指出，我们人类正面对淋病的双重危机。一方面，具有耐药性的淋球菌的比例越来越高；另一方面，得淋病的患者人数也在大幅增长。 从2013年到2017年，仅在美国，新诊断出来的病例就从33万例增加到56万例，上升67%。 与淋病同步大幅增加的还有梅毒和衣原体感染等其它性病。 Ram对造成这一趋势的原因进行了猜测：由于针对HIV的鸡尾酒疗法和小分子药越来越有效，人们不再象过去一样惧怕艾滋病，所以降低了性行为上的防范意识，因而引发了其它性病的泛滥。

Ram团队的策略是开发一种可以结合、清除淋球菌的单抗药。 他们选的先导药物是早在90年代就被发现的一个小鼠单抗（mAb 2C7），其靶点是淋球菌细胞膜上的脂寡糖（LOS）中的2C7表位。他们选择这个单抗主要有两个原因：

1.      普适性：在美国波士顿地区进行的一个研究中发现，从超过95%的患者中提取的淋球菌样品可以被它结合；而在另外一项研究中，从中国南京收集的所有样品都对它产生反应。

2.      2C7的重要性：2C7表位不仅被广泛表达，它也对淋球菌的致病性起着关键作用。小鼠实验表明， 如果敲除2C7表位，淋球菌的传染性会大大降低。

然而mAb 2C7对淋球菌的杀伤力并不强。Ram团队面临的下一个任务就是如何改造mAb 2C7，使它成为淋球菌的大杀器。到现在你可能已经猜出来了。是的，他们使用了HexaBody技术！

Ram团队与Genmab合作，在抗体的Fc区域引进了E430G突变。 在小鼠模型里，这个改造后的抗体(2C7-HexaBody)仅用了4天的时间就杀死了所有的淋球菌，治疗效果明显优于未经改造的抗体（图6）。而且这种疗效是完全通过CDC效应来实现的：引进了另一种突变K322A的抗体对淋球菌没有任何活性。突变K322A完全取消了CDC效应，但不会影响mAb 2C7和靶点及各种FcgR受体结合。另外，Ram团队还发现，2C7-HexaBody的杀菌作用离不开C1q和 C5蛋白，但不需要粒细胞的帮助。

如果说这三个报告串起来的故事还有不完美的地方，那就是2C7-HexaBody距离临床使用还有很长的路要走。 Ram团队和合作者正努力地把它开发成单抗候选药，现在进行的工作包括该抗体的人源化和剂型设计。 对于这个项目的进展和HexaBody技术的其它应用，我们将拭目以待。

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