​PNAS︱ 新发现！一种调节脑内神经元发育和促炎反应的小胶质细胞亚型

来源︱“逻辑神经科学”姊妹号：“岚翰生命科学”

撰文︱Tong

责编︱王思珍 

CD11c，亦称整合蛋白α X（integrin alpha X），由Itgax基因编码，是树突细胞（dendritic cell，DC）表达的特异蛋白，其与β2-整合蛋白（β2-integrin）结合介导DCs的吞噬过程[1]。在发育早期和一些神经退行性疾病（如阿尔兹海默症，AD）的条件下，中枢神经系统中也有一部分小胶质细胞会表达CD11c。CD11c⁺的小胶质细胞会表达Spp1在内的一些基因。

骨桥蛋白（osteopontin，OPN），由Spp1基因编码，是一种类似细胞因子的磷酸化蛋白，在外周血淋巴组织中参与病原性免疫反应和保护性免疫反应。其中DCs源OPN的功能包括：促进促炎应答、调控T helper细胞亚群的分化等[2-4]。

最近的一些研究表明，小胶质细胞来源的OPN与多发性硬化症、脊髓损伤、AD、肌萎缩性脊髓侧索硬化症（ALS）在内的多种中枢神经系统疾病有关[2]。但CD11c⁺ OPN⁺的小胶质细胞究竟是小胶质细胞激活的特征还是其标志着一个特定的遗传学机制，目前尚不清楚。

2022年2月22日，美国哈佛医学院和Dana-Farber癌症研究所的Harvey Cantor课题组在PNAS上发表了一篇题为“Definition of a mouse microglial subset that regulates neuronal development and proinflammatory responses in the brain”的文章，发现CD11c⁺的小胶质细胞亚群是由于出生前吞噬凋亡神经元形成的，是一个稳定的亚群。该亚群需要OPN介导突触蛋白的吞噬、增殖并转变成一种促炎的表型。

在DCs中，CD11c蛋白是介导吞噬作用的iC3b异源二聚体受体的重要组成部分。但在小胶质细胞中，CD11c只在小鼠出生后早期高表达，约3月龄时表达骤减。于是研究者们对健康的C57BL/6小鼠脑内CD11c⁺的小胶质细胞进行了观察。通过流式细胞术的方式（图1A）观察到CD11c⁺的小胶质细胞在胚胎发生后期开始出现（E18.5），在出生后5天时（P5），CD11c⁺的小胶质细胞数量约占小胶质细胞总数的8%，但在青年期几乎看不到CD11c⁺小胶质细胞（<1%）。然而在6-9月龄小鼠脑内，CD11c⁺的小胶质细胞再次出现，约占小胶质细胞总数的10%（图1B）。

图1：小胶质细胞在吞噬凋亡神经元后会由CD11c^-转变成CD11c⁺

（图源：Shen X, et al., PNAS, 2022）

有研究表明，小胶质细胞吞噬凋亡神经元（apoptotic neurons，ANs）后Itgax的表达会上调。于是研究者们提出：在小鼠出生早期小胶质细胞CD11c表达的上调是否与发育早期小胶质细胞对ANs的吞噬相关？作者通过磁珠分选的方式将CD11c⁺的小胶质细胞分选出来，并将其和带有荧光标记的ANs共培养72h。结果显示，23%的CD11c^-小胶质细胞吞噬了ANs，其中77.4%的AN⁺小胶质细胞都是CD11c⁺，并且有大约18%的CD11c^-小胶质细胞在与Ans共培养72h开始表达CD11c（图1C）。但脂多糖（LPS）和β-淀粉样蛋白（Aβ）的刺激并不会使CD11c^-小胶质细胞转变成CD11c⁺（图1D, E）。药物抑制ANs内吞则会减少小胶质细胞由CD11c^-向CD11c⁺的表型转变（图1F）。这些结果说明：小胶质细胞在吞噬凋亡细胞时会促使其由CD11c^-转变成CD11c⁺，小胶质细胞受体与ANs之间的作用增强，这种转变与传统的小胶质细胞激活不同。

接着，研究者们在实验过程中发现，只有CD11c⁺小胶质细胞会产生OPN，并且在ANs诱导的CD11c^- -> CD11c⁺转化过程中有显著的OPN表达上调（图2A, B）。那么OPN在此过程中起到了怎样的作用呢？结果显示，OPN敲除（KO）的新生小鼠（P5）CD11c⁺小胶质细胞中CD11c的表达下调了约75%，而9月龄的OPN KO小鼠CD11c的表达下调了约50%（图2 C, D）。于是研究者们使用类器官海马切片培养的方式模拟生理环境下小胶质细胞CD11c⁺表型的稳定性（该方式允许对内源性小胶质细胞进行替换）。结果发现，无论在P5还是9月龄的组织中野生型（WT）组CD11c⁺小胶质细胞数目基本不变，但OPN KO组CD11c⁺小胶质细胞数量显著减少（图2E, F）。这些结果提示：小胶质细胞找中CD11c的稳点表达需要OPN的共表达。

图2：OPN与CD11c⁺小胶质细胞稳定性有关

（图源：Shen X, et al., PNAS, 2022）

那么，CD11c⁺小胶质细胞和CD11c^-小胶质细胞究竟有怎样的区别呢？研究者们对两种表型的细胞进行了转录组学分析。其中P5 WT小鼠CD11c⁺小胶质细胞和CD11c^-小胶质细胞转录组学特征非常相似，但P5和9月龄小鼠CD11c⁺小胶质细胞和CD11c^-小胶质细胞中都存在一些特异性表达的基因（图3A），其中有4个基因在P5和9月龄时是CD11c⁺小胶质细胞特异表达的“核心基因”：Itgax、CD209a、CD209f和CD36（图3B, C）。 

图3：CD11c⁺和CD11c^-的小胶质细胞的转录组学特性

（图源：Shen X, et al., PNAS, 2022）

有文献报道，在新生儿大脑发育中，小胶质细胞可能有助于清除过多的神经突触[6]。作者疑问：OPN到底在CD11c⁺小胶质细胞中起什么作用呢？研究者发现，OPN KO小鼠会导致CD11c⁺小胶质细胞对突触吞噬的减少（约45%）（图4A）。体外实验也显示，P5的CD11c⁺ OPN⁺小胶质细胞对突触蛋白有很强的吞噬能力，在OPN缺失时，CD11c⁺小胶质细胞对突触蛋白的吞噬减少了约50%（图4B）。另外OPN缺失也会影响CD11c⁺小胶质细胞的增殖能力（图4C, D）。这说明OPN参与调控CD11c⁺小胶质细胞对突触的吞噬及增殖能力。

图4：OPN调控CD11c+小胶质细胞的吞噬及增殖

（图源：Shen X, et al., PNAS, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望

总之，研究者们发现CD11c⁺小胶质细胞代表着一个稳定的表型，这类小胶质细胞是中枢神经系统中唯一可以产生OPN的小胶质细胞，且CD11c⁺ OPN⁺小胶质细胞不是一种简单的、短暂的激活型小胶质细胞表型，它在出生后早期小胶质细胞吞噬ANs后形成，是一类稳定的、有促炎特性的小胶质细胞。

OPN的上调与许多神经系统疾病都相关（如AD、ALS，PD等），这项工作提出OPN只由CD11c⁺小胶质细胞产生，那么CD11c⁺ OPN⁺小胶质细胞在脑内的空间分布是怎样的呢？其与神经退行性疾病间又有着怎样的关系呢？ 这些问题还有待进一步研究。

原文链接：https://doi.org/10.1073/pnas.2116241119  

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[1]Wu J, Wu H, An J, et al. Critical role of integrin CD11c in splenic dendritic cell capture of missing-self CD47 cells to induce adaptive immunity [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2018, 115(26): 6786-91.

[2]Wlodarczyk A, Holtman I R, Krueger M, et al. A novel microglial subset plays a key role in myelinogenesis in developing brain [J]. EMBO J, 2017, 36(22): 3292-308.

[3]Keren-Shaul H, Spinrad A, Weiner A, et al. A Unique Microglia Type Associated with Restricting Development of Alzheimer's Disease [J]. Cell, 2017, 169(7): 1276-90 e17.

[4]Krasemann S, Madore C, Cialic R, et al. The TREM2-APOE Pathway Drives the Transcriptional Phenotype of Dysfunctional Microglia in Neurodegenerative Diseases [J]. Immunity, 2017, 47(3): 566-81 e9.

[5]Shen X, Qiu Y, Wight A E, et al. Definition of a mouse microglial subset that regulates neuronal development and proinflammatory responses in the brain [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2022, 119(8):

[6] E. Favuzzi et al., GABA-receptive microglia selectively sculpt developing inhibitory circuits. Cell 184, 4048–4063.e32 (2021). Correction in: Cell 184, 5686 (2021). 

制版︱王思珍

本文完