Autophagy︱沈汉明课题组揭示自噬相关蛋白WIPI2调控线粒体外膜蛋白降解及线粒体自噬的新机制
撰文︱卢广，沈汉明
责编︱王思珍
细胞自噬（autophagy）是细胞在外界环境变化或刺激下，通过对自身物质进行降解并再回收利用，从而维持细胞稳态及存活的一个进化高度保守的过程[1,2]。线粒体自噬（mitophagy）是一种选择性自噬，参与细胞内损伤或功能异常线粒体的清除，是线粒体质量调控（mitochondrial quality control）的关键机制[3]，在近年备受关注。线粒体自噬功能异常或缺失与人类多种疾病的发生发展密切相关，包括肿瘤、神经退行性疾病或衰老等[4]。
PINK1-Parkin介导的线粒体自噬是目前研究最为深入的机制。在线粒体膜去极化（depolarization）时，PINK1在线粒体外膜迅速聚集，后通过磷酸化线粒体上的泛素招募Parkin并进一步磷酸化激活Parkin。激活Parkin介导线粒体外膜蛋白的泛素化修饰，形成前馈环路（feed forward loop）进一步放大PINK1-Parkin依赖的线粒体自噬的通路[5]。
WIPI2是自噬体合成的关键蛋白，通过招募ATG12–ATG5-ATG16L1复合物从而促进LC3的脂质化及自噬体的形成[6,7]。目前WIPI2在非选择性自噬的研究较为深入，而其在选择性自噬尤其是线粒体自噬中的作用仍知之甚少。来自哈佛大学医学院的Harper教授课题组报道：在线粒体自噬诱导初期，WIPI2是招募至损伤线粒体的关键蛋白[8]，而其具体功能及调控机制仍有待进一步的研究。
2022年4月7日，新加坡国立大学/澳门大学的沈汉明教授团队在《自噬》（Autophagy）杂志上发表题为“WIPI2 positively regulates mitophagy by promoting mitochondrial recruitment of VCP”的研究论文，阐述了自噬相关蛋白WIPI2对线粒体自噬的正调控作用及其调控分子机制。中山大学中山医学院卢广副教授及新加坡国立大学生理系Hayden Weng Siong Tan博士为本文的共同第一作者，沈汉明教授为论文的通讯作者。
通过CCCP诱导线粒体膜去极化，作者发现，WIPI2被有效招募至损伤的线粒体（图1 B）。进一步的实验发现，WIPI2与线粒体自噬的关键货物蛋白（cargo receptor）包括OPTN及NDP52有共定位（图1 E, G）。这些结果（图1 ）提示：WIPI2在线粒体上的招募是线粒体自噬的早期事件。
图1 WIPI2在线粒体去极化时被招募至损伤的线粒体
（图源：Lu G, et al., Autophagy, 2022）
利用CRISPR-Cas9技术，作者构建了多个WIPI2敲除细胞，发现WIPI2敲除导致CCCP或OA诱导的线粒体外膜及内膜蛋白降解被阻断（图2 A-B）。利用mito-Keima方法，作者进一步证明WIPI2敲除导致线粒体自噬的抑制（图2 C-E）。这些结果提示：WIPI2对线粒体自噬有正调控作用。
图2 WIPI2敲除抑制线粒体自噬
（图源：Lu G, et al., Autophagy, 2022）
为了进一步研究WIPI2调控线粒体自噬的机制，作者通过质谱分析，发现VCP/p97（valosin containing protein，含缬酪肽蛋白）及其辅因子如UFD1是线粒体自噬诱导时与WIPI2相互作用的关键蛋白。已有多项研究报道VCP在线粒体自噬诱导时被招募至损伤的线粒体，从而介导被泛素化修饰的线粒体外膜蛋白的降解及线粒体自噬的发生[9,10]。作者随后验证两者的相互作用（图3 A-C），并发现VCP的N结构域是其与WIPI2相互作用所必须（图3 D-E）。VCP的N结构域是其与辅因子如UFD1及NPLOC4相互作用的关键结构域[11]，作者进一步验证WIPI2与后者之间的相互作用（图3 F）。这些结果提示：WIPI2与VCP-UFD1-NPLOC4复合物具有相互作用。
图3 WIPI2与VCP-UFD1-NPLOC4有相互作用
（图源：Lu G, et al., Autophagy, 2022）
由于VCP是介导线粒体外膜蛋白降解的关键蛋白，那么WIPI2敲除导致线粒体外膜降解的阻断是否与VCP有关？作者进一步发现在WIPI2敲除的细胞中，VCP在线粒体上的招募受损，而过表达WIPI2可逆转这一表型（图4）。这些结果提示：WIPI2是VCP招募至线粒体上的关键蛋白。
图4 WIPI2促进VCP在线粒体上的招募
（图源：Lu G, et al., Autophagy, 2022）
文章最后部分阐述WIPI2参与细胞命运的选择。线粒体自噬初期，线粒体外膜蛋白降解伴随线粒体破裂及促凋亡因子的释放[12]。在WIPI2敲除的细胞中，线粒体外膜蛋白降解被抑制，从而抑制了促凋亡因子（如细胞色素C）的释放及其他促凋亡因子的激活（图5 A-B），从而抑制了线粒体自噬诱导的细胞死亡（图5 C-E）。
图5 WIPI2敲除抑制线粒体自噬诱导的细胞凋亡
（图源：Lu G, et al., Autophagy, 2022）
图6 工作总结图：WIPI2通过招募VCP复合物促进线粒体自噬
（图源：Lu G, et al., Autophagy, 2022）
此外，该研究提示WIPI2参与调控真核细胞中的两大降解体系（即泛素-蛋白酶体和自噬-溶酶体降解途径）：一方面，WIPI2调控泛素-蛋白酶体依赖的降解；另一方面WIPI2作为自噬体合成的关键蛋白参与自噬-溶酶体的降解。这一研究拓展了WIPI2的功能范围及对线粒体自噬分子调控机制的理解。
这项研究也存在一些有待解决的问题。比如，WIPI2是如何被招募至损伤的线粒体上有什么样的因素会影响WIPI2与VCP的互作及VCP在线粒体上的招募？WIPI2对VCP的招募作用是否在其他细胞过程也存在？WIPI2调控的线粒体自噬具有什么生理病理学意义？对这一系列问题的探讨，将有助于加深对WIPI2的功能及线粒体分子机制的理解，为线粒体自噬缺陷相关疾病的防治提供理论支持。
原文链接：https://doi.org/10.1080/15548627.2022.2052461
第一作者卢广副教授（左），通讯作者沈汉明教授（中），共同第一作者Hayden Weng Siong Tan博士（右）
（照片提供自：沈汉明实验室网站）
该工作得到新加坡国教育部基金项目、新加坡国家医学项目、澳门大学校基金和澳门科技局基金等的支持。浙江大学刘伟教授、挪威奥斯陆大学方飞教授、南京大学方雷教授、浙江大学夏大静教授及吴一华教授、广西医科大学周静教授、湖南大学王立明教授和陆军军医大学贺伟峰教授等对本工作给予了大力支持。
通讯作者简介（上下滑动阅读）
沈汉明教授现任澳门大学健康科学学院讲座教授(Chair Professor)和医学生物系系主任。沈教授于1985年、1988年在浙江医科大学取得学士、硕士学位，于1996年在新加坡国立大学获得博士学位。自2001-2019年在新加坡国立大学医学院担任助理教授，副教授和正教授。至今已发表学术论文220余篇。主要研究领域为细胞自噬与肿瘤细胞生物学、线粒体自噬和肿瘤代谢等。目前担任国际权威杂志Autophagy副主编，J Cell Physiol 执行编委，Aging Cell 、Life Metabolism、和Burns & Trauma编委。
沈汉明教授在澳门大学健康科学学院的实验室有充分的实验空间和完备的实验设备，主要研究方向是细胞自噬包括线粒体自噬和肿瘤代谢，详情请访问https://fhs.um.edu.mo/hanming-shen/。现招聘推免研究生、博士研究生和博士后研究员，欢迎直接与沈教授联系（hmshen@um.edu.mo）
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【2】Cell Death Dis︱孔慧等揭示P2X7/NLRP3炎症小体通路在早期糖尿病视网膜病变中的作用
【3】Sci Adv︱刘兴国/田梅团队发现药物诱发帕金森综合征中线粒体清除新机制
【4】Front Aging Neurosci︱肠道准备可通过改变菌群组成影响术后谵妄
【5】Mol Psychiatry︱叶克强课题组揭示C/EBPβ/AEP信号通路介导了动脉粥样硬化及其诱发的阿尔兹海默症
【6】Neurosci Bull 观点文章︱在多任务下灵活分配有限工作记忆资源的机制
【7】Nat Commun︱温度周期驱动生物钟基因进化的新机制：timless多态性
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参考文献（上下滑动阅读）
1. Mizushima N. A brief history of autophagy from cell biology to physiology and disease. Nat Cell Biol. 2018 May;20(5):521-527.
2. Lu G, Wang L, Zhou J, et al. A Destiny for Degradation: Interplay between Cullin-RING E3 Ligases and Autophagy. Trends Cell Biol. 2021 Jun;31(6):432-444.
3. Pickles S, Vigie P, Youle RJ. Mitophagy and Quality Control Mechanisms in Mitochondrial Maintenance. Curr Biol. 2018 Feb 19;28(4):R170-R185.
4. Killackey SA, Philpott DJ, Girardin SE. Mitophagy pathways in health and disease. J Cell Biol. 2020 Nov 2;219(11).
5. Wang L, Qi H, Tang Y, et al. Post-translational Modifications of Key Machinery in the Control of Mitophagy. Trends Biochem Sci. 2020 Jan;45(1):58-75.
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7. Lu G, Yi J, Gubas A, et al. Suppression of autophagy during mitosis via CUL4-RING ubiquitin ligases-mediated WIPI2 polyubiquitination and proteasomal degradation. Autophagy. 2019 Nov;15(11):1917-1934.
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10. Kim NC, Tresse E, Kolaitis RM, et al. VCP is essential for mitochondrial quality control by PINK1/Parkin and this function is impaired by VCP mutations. Neuron. 2013 Apr 10;78(1):65-80.
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制版︱王思珍
本文完