Neurosci Bull︱钱令嘉课题组揭示同型半胱氨酸在慢性应激过程中通过调控DNA甲基化修饰影响认知功能

撰文︱王世达

责编︱王思珍

应激（stress）是指在受到各种内外界环境因素刺激时，机体所出现全身范围的非特异性反应[1]。随着近年来工作节奏加快，源于各方面的应激逐渐成为影响人类健康的潜在杀手。当前研究认为长时程高强度的应激对机体具有明确的损伤作用[2]，大脑作为负责动物识别并应对应激的高级器官同时极易受到应激的影响，主要体现在认知功能损害等方面。作为负责学习记忆与情绪的重要脑区，海马极易受到应激的影响[3]。大量研究发现慢性应激对海马具有损坏细胞结构，导致功能异常等诸多方面的负面效应[4]。但是相较于发现较早、结论较为充分的应激对海马结构损害，应激诱导认知损伤的分子机制尚未完全揭示。同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）是动物体内由甲硫氨酸转化而来的一种小分子氨基酸，流行病学研究发现在人群中Hcy水平与认知障碍的发生具有极为密切的关系[5]，且动物在处于应激条件下其血浆以及脑中Hcy水平显著升高。然而Hcy是否参与以及如何参与应激诱导的认知障碍发生尚不清楚。

2022年4月18日，军事医学研究院的钱令嘉课题组在《神经科学通讯》（Neuroscience Bulletin）上发表了题为“Homocysteine-Induced Disturbances in DNA Methylation Contribute to Development of Stress-Associated Cognitive Decline in Rats” 的研究论文，提出Hcy在慢性应激诱导认知损伤过程中的介导作用。王世达博士、王雪助理研究员为该论文的共同第一作者，谢方副研究员、钱令嘉研究员为该论文通讯作者。作者发现慢性应激诱导认知障碍出现，并且升高的Hcy是诱导认知障碍的一个重要原因，与此同时海马脑源性神经生长因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）水平降低；进一步机制研究发现升高的Hcy通过影响BDNF启动子DNA 5mC甲基化修饰抑制海马内BDNF转录及表达，最终导致认知损伤发生。该文从动物水平上丰富了应激诱导认知障碍的分子机制，并为控制应激提供了潜在靶点。

为了研究慢性应激过程中认知功能的改变以及Hcy的变化规律，作者首先使用8周慢性不可预见性温和应激模型（CUMS）模拟慢性应激对动物的影响，并分别在不同时间节点检测行为学改变和血浆Hcy水平。结果显示动物的认知功能随应激时程增加而降低，到第6周后降低稳定且显著（图1 A-E）。与此同时血浆Hcy水平随应激时程增加而升高（图1 F），且各项认知功能与Hcy呈现负相关关系（图1 G-J）。上述结果提示Hcy对认知功能之间具有显著的相关性。为了进一步明确Hcy是否是认知障碍的发生原因，作者分别在应激基础上补充B族维生素以及给予高蛋氨酸饮食分别实现Hcy的上调及下调（图1 K）。结果显示补充B族维生素下调Hcy可以改善由于应激导致的认知障碍，而高蛋氨酸饮食则可模拟由于应激对认知功能的影响（图1 L-O）。上述结果提示Hcy是应激诱导认知障碍发生的原因之一。

图1 Hcy是应激诱导唔知障碍发生的原因之一 

（图源：Wang SD, et al., Neurosci Bull, 2022）

进一步研究作者关注了应激过程中海马中BDNF转录及表达的改变规律，结果显示随着应激时程的增加，海马内BDNF基因转录及蛋白表达水平降低（图2 A, B），并且均与Hcy水平呈负相关关系（图2 C）。此外，下调Hcy后海马BDNF水平升高，海马树突棘密度较于应激基础上增加，而上调Hcy后BDNF水平降低，树突棘密度降低（图2 D-F）。提示Hcy在应激过程中对BDNF具有潜在负调控作用。为了明确BDNF改变是否参与应激过程中认知功能障碍，作者在应激干预的基础上对海马内BDNF实现了过表达（图2 G, I），结果显示过表达BDNF可以在不影响应激过程中较高的Hcy水平的基础上（图2 H）改善大鼠各项认知水平（图2 J-N），提示BDNF是应激导致认知障碍过程中Hcy的一个下游靶点。

图2 BDNF的下调与应激过程中认知障碍发生密切相关 

（图源：Wang SD, et al., Neurosci Bull, 2022）

鉴于Hcy参与机体甲基化代谢过程，作者在随后的研究中着重关注了应激过程中Hcy对DNA 5mC甲基化的影响。结果显示应激过程中Hcy导致海马甲基化潜能降低（图3 A），同时基因组DNA 5mC甲基化修饰程度降低（图3 B）。作者还关注了甲基代谢酶的改变，结果显示Hcy导致DNMT1和3b表达水平升高，而其余DNA 5mC甲基化代谢酶表达水平未发生明显改变（图3 C）。为了进一步研究Hcy对BDNF基因启动子甲基化的影响，作者使用甲基特异性PCR实验以及Sequenom测序技术对其进行了检测，结果显示Hcy在应激过程中导致BDNF启动子DNA 5mC甲基化水平升高，并且不同“CG”位点甲基化的改变程度及趋势均不同（图3 D, E），提示启动子某段序列的甲基化改变反映了序列上若干位点甲基化改变的综合状态。

图3 Hcy对海马BDNF启动子甲基化具有调控作用 

（图源：Wang SD, et al., Neurosci Bull, 2022）

为了最终确认BDNF启动子甲基化改变是否直接影响了其转录及表达水平，作者在应激动物的基础上通过过表达主动去甲基酶—TET1的方式实现对海马甲基化的调控，并关注了BDNF的改变以及对认知功能的影响。结果显示过表达TET1有效降低了应激动物海马BDNF启动子5mC甲基化水平（图4 F），同时BDNF水平升高显著，海马神经元树突棘密度增加（图4 A-E），认知功能得到恢复（图4 G-J）。 上述结果提示：BDNF基因启动子甲基化修饰升高可能与其转录及表达抑制有关，但具体机制仍需进一步研究。

图4 过表达TET1下调BDNF启动子甲基化水平并改善认知功能 

（图源：Wang SD, et al., Neurosci Bull, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，该研究从在体实验层面出发，发现升高的同型半胱氨酸（Hcy）是应激性认知障碍发生的重要原因之一，并且进一步通过上调海马中脑源性神经生长因子（BDNF）基因启动子区DNA 5mC甲基化修饰水平进而对该基因转录过程发挥阻碍作用。这一结果从表观遗传学角度丰富了慢性应激对认知障碍发生的机制，同时该研究中所提出的复合B族维生素干预Hcy以及TET1干预甲基化分别为应激性认知障碍的预防和干预治疗提供了潜在的靶点依据。但同时，尽管作者使用TET1实现了对BDNF启动子甲基化的调节，但作为非特异性的干预手段，TET1可能在此过程中对其他基因的甲基化修饰同样存在调节作用，因此在后续研究中应首要选择特异性干预手段进行研究。另外，BDNF启动子5mC甲基化阻碍其基因转录及蛋白表达的具体机制还需进一步研究。

原文链接：https://doi.org/10.1007/s12264-022-00852-7

第一作者王世达（左一）、王雪（左二）；通讯作者谢方（右二）、钱令嘉（右一）

（照片提供自：钱令嘉实验室）

基金支持：国家自然科学基金（31771290、81702454），北京市自然科学基金（5222033），国家科学工业局基础科研计划（JCKY2019548B001）。

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[1] SAPOLSKY R M. Stress and the brain: individual variability and the inverted-U [J]. Nat Neurosci, 2015, 18(10): 1344-6.

[2] BRYANT R A. The Current Evidence for Acute Stress Disorder [J]. Curr Psychiatry Rep, 2018, 20(12): 111.

[3] KIM E J, PELLMAN B, KIM J J. Stress effects on the hippocampus: a critical review [J]. Learn Mem, 2015, 22(9): 411-6.

[4] MCEWEN B S. Neurobiological and Systemic Effects of Chronic Stress [J]. Chronic Stress (Thousand Oaks), 2017, 1.

[5] JIANG B, YAO G, YAO C, et al. The effect of folate and VitB(12) in the treatment of MCI patients with hyperhomocysteinemia [J]. J Clin Neurosci, 2020, 81: 65-9.

制版︱王思珍

本文完