GLIA︱白贤淑/Frank Kirchhoff团队发现一群OPC不表达Olig2，急性脑损伤和学习活动可促进这群细胞的形成

撰文︱方礼跑，白贤淑

责编︱王思珍，方以一

编辑︱王如华

在中枢神经系统中，少突胶质细胞(Oligodendrocyte，OL)是唯一一种可以形成髓鞘的胶质细胞。少突胶质祖细胞（oligodendrocyte precursor cell，OPC），做为OL的前体细胞，在整个生命过程中持续增殖并分化成OL[1]。Olig2是一种基本螺旋环螺旋（basic helix-loop-helix，bHLH）转录因子，广泛表达于OL谱系细胞中（包括OPC和成熟OL），对OL谱系细胞的发育分化起重要作用，且在谱系的不同阶段其发挥的作用也各有不同[2]。因此，Olig2常常被用作OL谱系细胞的标志物。NG2（nerve/glia antigen 2）是chondroitin sulphate proteoglycan 4（cspg4），在生理条件下由OPC和周细胞（pericyte）特异性表达。近年的研究表明脑内存在一群NG2免疫阳性（以下简称为阳性）同时Olig2免疫阴性（阴性）的细胞[3, 4]。我们以往的工作表明在急性脑损伤条件下也会有一部分小胶质细胞表达NG2蛋白。此外，NG2蛋白胞外端在病理条件下极易被水解并黏附到其他细胞表面[5]。因此，NG2蛋白的免疫反应性本身并不一定能真正表示该细胞是否表达NG2蛋白，更不能表示这些细胞是OPC。因此，脑内是否真正存在不表达Olig2的OPC尚不清楚。若存在，我们还不清楚它们的数量是保持不变还是可被调控？他们的功能是否与Olig2阳性的OPC不同？

2022年10月29日，德国萨尔大学分子生理学系的白贤淑和Frank Kirchhoff（欧洲科学院院士）团队在GLIA上发表了题为“A subset of OPCs do not express Olig2 during development which can be increased in the adult by brain injuries and complex motor learning”的研究论文。德国萨尔大学方礼跑博士研究生为论文第一作者，萨尔大学白贤淑课题组组长和Frank Kirchhoff教授为论文共同通讯作者。该研究利用OPC特异性抗体血小板衍生生长因子受体α(platelet derived growth factor receptor alpha, PDGFRα)结合转基因鼠, 发现在正常小鼠脑内，有一群少突胶质祖细胞不表达Olig2，这些细胞富集于幼年小鼠脑内，而随着年纪增加其数量也随之减小几近消失。有趣的是，在脑损伤时或者学习训练下这群特殊OPCs的数量明显增加。

作者利用少突胶质祖细胞（OPC）特异性抗体PDGFRα标记OPC，发现在出生后（postnatal，p）14小鼠脑内的不同脑区 （包括皮层、胼胝体、海马CA1和齿状回）都能检测到PDGFRα^posOlig2^neg的细胞 （图1）。为了确认Olig2阴性并非由PFA固定引起的抗原破坏导致，作者使用了三种不同的抗原修复方法进行处理。在经过不同方法的抗原修复处理后，都可以在皮层检测到约3.5%的PDGFRα^pos细胞不表达Olig2, 提示在健康小鼠脑内确实存在Olig2^negPDGFRα^pos细胞。

图1 在幼年小鼠脑内，存在Olig2阴性的少突胶质组细胞

（图源：Fang LP, et al., GLIA, 2022）

为了进一步证实这些PDGFRα^posOlig2^neg细胞的确是OPC，作者使用了针对不同细胞类型的特异性抗体进行了免疫染色，发现所有这类特殊的OPC都表达NG2蛋白 (OPC特异性标志物)，但几乎不表达另一OL谱系标志物Sox10。同时，这些细胞也不表达其他类型细胞的特异性标志物，包括神经元（NeuN）、星型胶质细胞（GFAP/glutamine synthetase，GS）、小胶质细胞（IBA1/CD68）、前体细胞（Nestin/Sox2/double cortin，DCX）、少突胶质细胞（CC1）。从而证明这些PDGFRα^posOlig2^neg细胞确实是OPC。为了进一步验证这一结论，作者利用NG2-CreERT2xRosa26-fSTOPf-tdTomato双重转基因小鼠去标记OPCs。在出生后第14天，这些小鼠脑内同样被检测出了tdTomato^posPDGFRα^posOlig2^neg的细胞(图2），从而证明了在健康小鼠脑内确实存在不表达Olig2转录因子的OPC。

图2 PDGFRα^posOlig2^neg的细胞确系少突胶质祖细胞

（图源：Fang LP, et al., GLIA, 2022）

为了探究这些细胞群体是否一直存在于整个生命过程中，作者收集了不同年龄的小鼠大脑进行了染色分析。作者发现，在p5幼鼠的多个脑区均可检测到Olig2^negOPC，并且其细胞密度随着年龄增加而增加，在p14达到峰值。但此后密度随着年龄增加而减少，在成年小鼠脑内几乎观察不到这类细胞 (图3)。值得注意的是，在胚胎期的小鼠脑中，作者也观察到Olig2^negOPC存在，其比例约为有7%。

图3 Olig2阴性的少突胶质祖细胞大量出现在幼年小鼠脑内

（图源：Fang LP, et al., GLIA, 2022）

为了阐释这群细胞的数量改变的原因，作者首先利用细胞凋亡标志物（cleaved caspase 3, CC-3）和小胶质细胞吞噬标志物（CD68）对这类细胞进行了免疫染色，却并未在这类细胞里检测到CC-3，也没有在细胞周围观察到CD68阳性的吞噬小体，排除了凋亡或小胶质细胞吞噬导致的细胞密度减少。下一步，作者利用BrdU测定法检测了这类细胞的增殖能力。为了区分快速与慢速增殖，作者采用了两种BrdU标记法，即两小时快速标记法和三天长期标记法。当作者给p14的小鼠腹腔内单次注射BrdU两小时后进行免疫染色分析，不同于标记了7%的Olig2^posOPC，所有的Olig2^negOPC都没有被BrdU标记上。当作者在p12-14连续注射三天BrdU，则有10%左右的Olig2^negOPC结合了BrdU，然而Olig2^posOPC的标记率高达29%左右(图4)。这些结果表明，Olig2^negOPC自身增殖速率可能非常慢，更有可能是从增值速率较快的Olig2^posOPC转变而来。为了进一步确认Olig2^negOPC增殖与否，作者检测了Olig2^negOPC是否表达有丝分裂标志物（Ki67）。染色结果表明，所有脑区内均有10%左右（除了在胼胝体有30%左右）的Olig2^posOPC处于有丝分裂期，而几乎所有Olig2^negOPC都未呈现Ki67免疫阳性，进而证实了Olig2^negOPC的增殖速度显著低于Olig2^posOPC，推测Olig2^negOPC来自于Olig2^posOPC的分化。

图4 Olig2阴性的少突胶质组细胞增殖活性极低

（图源：Fang LP, et al., GLIA, 2022）

既然Olig2对OPC的分化起着至关重要的作用，那么这群Olig2阴性的OPC是否还能继续分化成OL？在分化过程中，OPC会延伸出更多突起，其细胞形态会变得更加复杂。因此，作者利用Imaris图像分析软件分析比较了Olig2^neg和Olig2^posOPC的形态结构。作者发现Olig2^negOPC的细胞突起较短且分叉较少，形态上更倾向于前体细胞。这些结果表明Olig2^negOPC是一群增殖速率极慢且更倾向于保持在前体细胞状态的OPC亚群。

神经网络建立发生在出生后第一周到第四周内，而OPC也通过与神经元形成突触联系参与神经网络的建立(自p5起) [6]。这一时间段正好与Olig2^negOPC的出现时期一致。为了验证这两者之间的因果关系，作者采用了大脑急性损伤模型以及运动学习，从两个角度来改变脑内活性从而观察Olig2^negOPC的数量变化。在急性脑损伤手术后3天，皮层损伤处的Olig2^negOPC的数目大量增加，并且在（至少）术后第10天仍能在损伤处观察到大量Olig2^negOPC的存在(图5)。在脑卒中模型和红藻氨酸（Kainic acid）诱导的癫痫模型中，同样观察到了大量Olig2^negOPC出现在损伤部位。这些结果显示，在成年小鼠脑内，脑活性改变可以诱导Olig2^negOPC的形成。

既然在健康成年小鼠脑内这类细胞几乎检测不到，而急性脑损伤条件下这类细胞又快速出现，那么这些细胞从哪里来？上述BrdU实验结果提示这类细胞可能从Olig2^posOPC转化而来。为了证实这一假设，作者选择对NG2-CreERT2 x Rosa26-fSTOPf-GCaMP3转基因小鼠（可标记OPCs）进行急性脑损伤处理。小鼠在出生后第六周起（即损伤前两周）不间断的喝两周含有BrdU的水，使得在期间增殖或曾经增殖的细胞(包括OPC)会整合上BrdU。在术后3天，作者观察到在对侧皮层所有Olig2^negOPC并未被标记上BrdU，而有47.5%左右Olig2^posOPC标记上了BrdU，再次证明Olig2^negOPC不增殖或增殖非常慢。但是，在损伤侧皮层，作者发现有约7%的Olig2^negOPC被标记上BrdU，提示这类细胞极有可能从Olig2^posOPC转变而来而并非自身增殖。为了进一步验证Olig2^negOPC的极低赠者能力，作者检测了损伤处Olig2^negOPC是否表达有丝分裂期标志物Ki67。免疫染色结果表明这些细胞并不表达Ki67， 从而证实损伤处的Olig2^negOPC同样表现出极低增殖活性，可能该细胞是来源于Olig2^posOPC分化。这也同样说明了当细胞外环境改变时，Olig2^posOPC可以转变其表型，降低Olig2的表达水平。

图5 急性脑损伤诱导Olig2阴性的少突胶质组细胞数目急剧增加

（图源：Fang LP, et al., GLIA, 2022）

既然Olig2^negOPC的出现与脑内神经环路活性改变有关，那么生理条件下是否也能促成Olig2^negOPC的形成呢？为了回答这一问题，作者连续三周训练成年小鼠在Erasmus Lader上完成复杂的运动，即小鼠要学会在有无预警条件下均克服路障成功走过Erasmus Lader。在学习过程中，小鼠海马区神经元不断受运动学习刺激并形成新的神经环路，最终这些小鼠能够快速高效地克服路障，成为“超鼠”。三周学习结束后，在这些“超鼠”的海马区，尤其在齿状回，Olig2^negOPC的数目显著增加(图6)。从而再次证实Olig2^negOPC的出现与脑内神经环路活性密切相关。

图6 运动学习使海马齿状回的Olig2^negOPC数量增加

（图源：Fang LP, et al., GLIA, 2022）

图7 Olig2^negOPC内细胞分化和髓鞘形成相关基因表达下调

（图源：Fang LP, et al., GLIA, 2022）

不期而遇，作者通过分析已发表的单细胞测序结果发现在RNA水平上也有一群OPC不表达Olig2。通过Gene Ontology分析发现参与细胞分化和髓鞘形成的相关基因在Olig2^neg细胞中表达下调。

文章结论与讨论，启发与展望综上所述，该研究结合转基因技术和免疫染色方法揭示了在健康小鼠脑内存在一群不表达Olig2转录因子的OPC。这一亚群细胞的数量与脑神经回路的活性变化正相关。相比于Olig2^posOPC, Olig2^negOPC细胞更多地参与神经环路建立，但压抑增殖和分化能力。这一研究对调控神经环路活性提出了新的可能性。由于这些细胞的检测仅基于免疫染色结果，很难实时追踪这些细胞，因此，该研究并未能直接证明Olig2^negOPC是由Olig2^posOPC转变而来。并且这些“新”的Olig2^neg OPC的生理特性是否与Olig2^posOPC不同也有待解答。因此，未来或许可以通过使用Olig2-EGFP与PDGFRα-DsRed双重转基因小鼠进行实时追踪，从而解答这些细胞的命运转变问题。

原文链接：https://doi.org/10.1002/glia.24284

第一作者：方礼跑（左）；通讯作者：Frank Kirchhoff（中）、白贤淑（右）

（照片提供自：白贤淑和Frank Kirchhoff团队）

通讯作者简介（上下滑动阅读）

方礼跑，德国萨尔大学分子生理系在读博士研究生（University of Saarland，Molecular Physiology）自2018年9月加入白贤淑课题组参与该课题，攻读博士期间，以独立第一作者身份分别在Nature communication 和 GLIA 杂志发表了研究论文，并在Frontiers in cellular neuroscience 和Journal of Neurochemistry杂志参与发表了研究论文。

Frank Kirchhoff教授，德国萨尔大学医学院分子生理系终生教授，德国神经科学学会副主席，欧洲科学院院士（Academia Europaea）。Frank Kirchhoff教授多年从事胶质细胞与神经元之间的联系，并在Science，Nature, Neuron等神经科学领域顶级期刊上发表了百余篇文章。

白贤淑，课题组组长，博士期间师从Frank Kirchhoff教授，已发表10多篇SCI论文。自2018年起在分子生理学系建立独立课题组，利用多种转基因小鼠和双光子在体成像技术，研究神经细胞与胶质细胞的联系。

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参考文献（上下滑动阅读） 

[1] Trotter, J., Karram, K., & Nishiyama, A. (2010). NG2 cells: Properties, progeny and origin. Brain Res Rev, 63(1-2), 72-82. doi:10.1016/j.brainresrev.2009.12.006

[2] Mei, F., Wang, H., Liu, S., Niu, J., Wang, L., He, Y., . . . Xiao, L. (2013). Stage-specific deletion of Olig2 conveys opposing functions on differentiation and maturation of oligodendrocytes. J Neurosci, 33(19), 8454-8462. doi:10.1523/JNEUROSCI.2453-12.2013

[3] Buffo, A., Vosko, M. R., Ertürk, D., Hamann, G. F., Jucker, M., Rowitch, D., & Götz, M. (2005). Expression pattern of the transcription factor Olig2 in response to brain injuries: implications for neuronal repair. Proc Natl Acad Sci U S A, 102(50), 18183-18188. doi:10.1073/pnas.0506535102

[4] Ligon, K. L., Kesari, S., Kitada, M., Sun, T., Arnett, H. A., Alberta, J. A., . . . Rowitch, D. H. (2006). Development of NG2 neural progenitor cells requires Olig gene function. Proc Natl Acad Sci U S A, 103(20), 7853-7858. doi:10.1073/pnas.0511001103

[5] Huang, W., Bai, X., Meyer, E., & Scheller, A. (2020). Acute brain injuries trigger microglia as an additional source of the proteoglycan NG2. Acta Neuropathol Commun, 8(1), 146. doi:10.1186/s40478-020-01016-2

[6] Bai, X., Zhao, N., Huang, W., Caudal, L., Zhao, R., Hirrlinger, J., . . . Scheller, A. (2021). After traumatic brain injury oligodendrocytes regain a plastic phenotype and can become astrocytes. bioRxiv, 2021.2006.2018.448919. doi:10.1101/2021.06.18.448919

本文完