突触是神经元进行信息交流与整合的关键结构，由前、后突触构成。典型的谷氨酸能突触包含两种离子型谷氨酸受体，AMPA受体（AMPARs）和NMDA受体（NMDARs）。大多数新生成的谷氨酸能突触缺乏功能性AMPARs及其介导的突触传递功能，这一类突触，通常被称为沉默突触（silent synapses）[1-2]。发育时期大量存在的silent synapses有效地介导突触增强，并有助于在关键时期增强可塑性。随着发育，silent synapses大量减少，但依旧可以在学习刺激下生成[3]，并与多种神经疾病密切相关[4-5]。而目前缺乏对silent synapses调控机制的研究。微小RNA（microRNAs, miRNAs）是转录后调控的重要小分子，在神经系统中有着重要的调节作用。其中，miR-34a在大脑中高度表达，并随着大脑发育的成熟，其表达逐渐升高并趋于稳定[6-7]。miR-34a对神经发育有着重要的调控作用[8-9]，而其在成熟大脑中的作用鲜为人知。对此，中科院上海有机所生物与化学交叉研究中心的何凯雯团队对miR-34a在成熟大脑中的神经功能进行研究，并于2023年1月13日在Progress in Neurobiology期刊上在线发表题为“miR-34a regulates silent synapse and synaptic plasticity in mature hippocampus”的文章，阐述了miR-34a在成熟大脑中的一种未知的生理功能，揭示了silent synapses的一个重要调控机制。闵霞为论文第一作者，何凯雯研究员为论文通讯作者。在此项研究中，作者在成熟的34a_ht (Heterozygous miR-34a knockout）小鼠海马体中发现了更多的silent synapses，促进了NMDARs 的突触功能、突触可塑性——长时程增强（long-term potentiation, LTP）以及空间学习能力的增强。进一步的机制研究提出miR-34a直接靶向调控转录因子Creb1。成熟34a_ht小鼠海马体中CREB1表达及激活程度上调与silent synapses的增加相关。
34a_ht成熟小鼠海马体转录本数据显示，miR-34a可能参与了突触功能水平的调控。由此，作者首先利用胞外突触后场电势记录（extracellular field excitatory postsynaptic potential，fEPSP）方法比较了Schaffer collateral CA1 的基本突触传递功能。作者观察到，仅在成熟的34a_ht小鼠的海马体中NMDARs功能显著增强，而这一现象在幼鼠中并未发生。而NMDARs的突触功能增强可能是通过：①增加突触后NMDARs的表达或者亚基组成得以改变[10-13]；②或者是拥有更多的只含有NMDARs的silent synapses造成[1,2,14]。为了区分与验证这两个猜想，作者分别记录了AMPAR 与NMDAR 介导的微型兴奋性突触后电流（miniature excitatory postsynaptic currents, mini EPSCs）。AMPAR-mEPSCs的振幅与频率都没有发生改变，这与fEPSPs观察到的未改变的AMPAR功能和突触前释放功能的结果是一致的。而NMDAR-mEPSCs的振幅与电流衰减动力学特征未发生改变，否定了前一个猜想；不仅如此，NMDAR-mEPSCs的频率显著升高，暗示了第二种猜想的可能。由此，作者通过经典的检验silent synapses含量的实验方法——微刺激试验（minimal stimulation assay）检测成熟34a_ht小鼠CA1神经元的silent synapses含量。该方法验证了猜想二，成熟34a_ht小鼠CA1神经元有更高比例的silent synapses。至此，作者通过这些电生理数据证实，在成熟小鼠海马体中，下调miR-34a会促进silent synapses生成。更多的silent synapses往往伴随着树突棘密度的改变。由此，作者也通过荧光蛋白标记与比较了34a_ht成熟小鼠与同窝野生型（wild type, WT）小鼠海马体中的树突棘密度。实验结果与此前结果吻合，34a_ht成熟小鼠海马体 CA1神经元的第二、三级树突分支上的树突棘密度更高。同时，作者也富集提取了海马体的突触后致密物（postsynaptic density，PSD），比较等量PSD中的AMPARs与NMDARs的含量，即突触受体密度。作者观察到34a_ht成熟小鼠海马体中的AMPARs突触后密度显著降低，这与该小鼠有更多的silent synapses结果一致。至此，作者通过形态学与突触后受体表达分布的实验再次验证了成熟34a_ht小鼠的海马体中有更多的silent synapses。作者紧接着探索miR-34a调控silent synapses生成的可能机制。在看到34a_ht成熟小鼠CA1神经元的树突棘更多后，作者首先检测了突触后受体的总表达水平，并观察到受体亚基GluN1、GluN2B、GluA1和支架蛋白PSD95的微弱升高。比较意外的是，除了GluN2B是miR-34a的靶标，其余蛋白及其基因都不是miR-34a的靶向对象。这样的现象向作者暗示了miR-34a可能是通过调控其余靶标间接调控了这些突触蛋白的表达与silent synapses的生成。Creb1是经典的参与调控突触发生与突触可塑性的转录因子，也被报道其激活态的过表达会诱导生成更多的silent synapses[15-20]。巧合的是，作者发现Creb1 mRNA 3' UTRs有2处miR-34a的靶标位点。事实上，作者也通过双荧光素酶报告（firefly luciferase assay）实验验证到miR-34a直接调控Creb1。同时，34a_ht成熟小鼠海马体中确实有更高表达水平与激活态的CREB1。这些结果表明，miR-34a直接靶向Creb1，进而可能控制关键突触蛋白的表达，并可能有助于成熟海马中沉默突触的产生。Silent synapses激活后招募AMPARs到突触后膜，转化为功能性突触，是LTP的一个重要机制[4,21]。那么34a_ht小鼠的海马体中更多的silent synapses是否意味着有更强的LTP？作者也同样给予了实验验证。作者通过fEPSPs记录观察到仅成熟34a_ht小鼠在Schaffer collateral CA1区域有更强的LTP，幼鼠无此现象。而LTP是学习与记忆的细胞机制[22]，作者也后续检测了与海马功能紧密相关的空间学习记忆行为表型。作者发现，34a_ht成熟小鼠有着更好的空间学习能力，伴随着略微升高的空间记忆。至此，实验结果表明：成熟34a_ht小鼠海马的LTP增强，伴随着空间学习能力的增强。图1 miR-34a在成年小鼠海马体中新功能：调控沉默突触与突触可塑性
（图源：Min X, et al., Prog Neurobiol, 2023）文章结论与讨论，启发与展望综上所述，该研究结合电生理、分子生化、动物行为、生物信息学及统计学等多种手段，首次发现了miR-34a在成熟大脑中的一种新的生理功能，揭示了silent synapses的一个重要的调控机制，开拓了研究与健康及疾病状态密切相关的silent synapses的生成的新视角（图1）。不足的是，该研究并没有直接证据表明Creb1是miR-34a调控silent synapses的关键目标，仅讨论了相关性，后续仍然需要利用拯救实验等，确定两者之间的关系。
另外，作者也提出，在一些神经疾病中异常存在的silent synapses也是一个很有趣的研究方向。在这些疾病条件下，什么样的分子信号可能会触发silent synapses的产生，这在很大程度上尚不清楚。miR-34a是否参与其中有待研究。原文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0301008223000047该研究受国家自然基金委、上海市科技发展基金、上海市科技重大专项等基金支持。
通讯作者：何凯雯（正中间）； 第一作者：闵霞（右六）（照片提供自：科院上海有机所生物与化学交叉研究中心何凯雯团队）通讯作者：何凯雯（一排左一）； 第一作者：闵霞（一排左四） （照片提供自：科院上海有机所生物与化学交叉研究中心何凯雯团队）
学习资料【1】收藏+免费︱脑科学视频课程 & 9大手术造模和细胞分子科研手册资料
参考文献（上下滑动查看）
[1] Isaac, J.T.R., Nicoll, R.A. & Malenka, R.C. Evidence for silent synapses: Implications for the expression of LTP. Neuron 15, 427-434 (1995).[2] Liao, D., Hessler, N.A. & Malinow, R. Activation of postsynaptically silent synapses during pairing-induced LTP in CA1 region of hippocampal slice. Nature 375, 400-404 (1995).[3] Wang, Y., Liu, Y.Z., Wang, L., Tang, W. & Wang, Z. Silent Synapse Unsilencing in Hippocampal CA1 Neurons for Associative Fear Memory Storage. Cereb Cortex 29, 4067-4076 (2019).[4] Hanse, E., Seth, H. & Riebe, I. AMPA-silent synapses in brain development and pathology. Nat Rev Neurosci 14, 839-850 (2013).[5] Koya, E., et al. Silent synapses in selectively activated nucleus accumbens neurons following cocaine sensitization. Nat Neurosci 15, 1556-1562 (2012).[6] Bommer, G.T., et al. p53-mediated activation of miRNA34 candidate tumor-suppressor genes. Curr Biol 17, 1298-1307 (2007)[7] Jauhari, A., Singh, T., Singh, P., Parmar, D. & Yadav, S. Regulation of miR-34 Family in Neuronal Development. Mol Neurobiol 55, 936-945 (2018).[8] Aranha, M.M., Santos, D.M., Sola, S., Steer, C.J. & Rodrigues, C.M. miR-34a regulates mouse neural stem cell differentiation. PLoS One 6, e21396 (2011).[9] Agostini, M., et al. microRNA-34a regulates neurite outgrowth, spinal morphology, and function. Proc Natl Acad Sci U S A 108, 21099-21104 (2011).[10] Carroll, R.C. & Zukin, R.S. NMDA-receptor trafficking and targeting: implications for synaptic transmission and plasticity. Trends Neurosci 25, 571-577 (2002).[11] Lau, C.G. & Zukin, R.S. NMDA receptor trafficking in synaptic plasticity and neuropsychiatric disorders. Nat Rev Neurosci 8, 413-426 (2007).[12]. Kohr, G. NMDA receptor function: subunit composition versus spatial distribution. Cell Tissue Res 326, 439-446 (2006).[13] Paoletti, P., Bellone, C. & Zhou, Q. NMDA receptor subunit diversity: impact on receptor properties, synaptic plasticity and disease. Nat Rev Neurosci 14, 383-400 (2013).[14] Kerchner, G.A. & Nicoll, R.A. Silent synapses and the emergence of a postsynaptic mechanism for LTP. Nat Rev Neurosci 9, 813-825 (2008).[15] Lee, S.H., et al. Nuclear translocation of CAM-associated protein activates transcription for long-term facilitation in Aplysia. Cell 129, 801-812 (2007).[16] Lonze, B.E. & Ginty, D.D. Function and regulation of CREB family transcription factors in the nervous system. Neuron 35, 605-623 (2002).[17] Lisman, J., Cooper, K., Sehgal, M. & Silva, A.J. Memory formation depends on both synapse-specific modifications of synaptic strength and cell-specific increases in excitability. Nat Neurosci 21, 309-314 (2018).[18]. Aguado, F., et al. The CREB/CREM transcription factors negatively regulate early synaptogenesis and spontaneous network activity. J Neurosci 29, 328-333 (2009).[19] Marie, H., Morishita, W., Yu, X., Calakos, N. & Malenka, R.C. Generation of silent synapses by acute in vivo expression of CaMKIV and CREB. Neuron 45, 741-752 (2005).[20] Brown, T.E., et al. A silent synapse-based mechanism for cocaine-induced locomotor sensitization. J Neurosci 31, 8163-8174 (2011).[21] Vincent-Lamarre, P., Lynn, M. & Beique, J.C. The Eloquent Silent Synapse. Trends Neurosci 41, 557-559 (2018)[22] Martin, S.J., Grimwood, P.D. & Morris, R.G. Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis. Annu Rev Neurosci 23, 649-711 (2000).