EMBO J｜郭伟翔课题组揭示L-精氨酸稳态调控成体神经干细胞活化的分子机制

撰文︱郭伟翔，徐铭悦

责编︱王思珍，方以一

编辑︱王思珍

在成年哺乳动物大脑中，海马的齿状回存在着成体神经干细胞（adult neural stem cell），并且能够不断产生新生神经元。成体海马神经发生（adult hippocampal neurogenesis）主要参与大脑可塑性及学习记忆等行为[1-3]。大多数成体神经干细胞处于静止状态（quiescent states）。然而，在外部刺激下，它们可以从静止状态中退出，重新激活产生新的神经元。神经干细胞静止态和激活态（active states）之间的平衡对于保持神经干细胞的数量（也就是神经干细胞库）以及维持大脑稳态和功能起着至关重要的作用。神经干细胞过度处于静止状态，则导致神经干细胞不能够产生足够的新生神经元维持其功能；而神经干细胞的过度活化最终会导致神经干细胞库（neural stem cell pool）衰竭，也会最终导致其功能的丧失。

过去的研究已经系统地阐明了形成素（morphogene）介导的信号通路和转录因子对成体神经干细胞以及成体神经发生的调控机理[4,5]。近年来，研究发现细胞代谢对神经干细胞身份的维持和分化起着关键作用[6]。细胞代谢决定了细胞的能量状态，与神经干细胞的活性和神经的分化密不可分。然而，细胞代谢的稳态是如何调控神经干细胞静止和激活之间的平衡仍然不清楚。

近日，中国科学院遗传与发育生物学研究所郭伟翔课题组在The EMBO Journal上发表了题为“L-arginine Homeostasis Governs Adult Neural Stem Cell Activation by Modulating Energy Metabolism in vivo”的研究论文，揭示了精氨酸酶-II（Arginase-II）介导的细胞内精氨酸稳态通过影响细胞代谢重塑，从而维持成体神经干细胞库和成体神经发生的分子机制。郭伟翔课题组博士生徐铭悦为论文第一作者，郭伟翔研究员为论文通讯作者。（拓展阅读：郭伟翔课题组相关研究进展，详见“逻辑神经科学”报道（点击阅读）：J Neurosci︱郭伟翔课题组揭示Ⅱ型高赖氨酸血症的神经代谢紊乱的病理机制）

作者发现Arginase-II表达于成体神经干细胞以及其分化的细胞谱系中。作者利用全身性敲除Arginase-II的KO成年小鼠，通过BrdU（5-溴脱氧尿苷）腹腔注射标记处于细胞增殖周期S期的细胞和内源Mcm2免疫荧光染色处于细胞增殖周期的细胞，揭示了神经干细胞处于过度激活的状态（图1）。这一类似现象，也在成体神经干细胞（Arginase-II^f/f ::Nestin-CreER^T2::Ai14）特异性敲除Arginase-II的cKO成年小鼠中得到了验证。这一结果提示Arginase-II在成体神经干细胞库的维持起着至关重要的作用。

图1. Arginase-II的缺失导致神经干细胞处于过度激活的状态

（图源：Xu ,MY. et al., EMBO J, 2023）

成体神经干细胞可以通过退出和进入细胞周期在激活态和静息态之间来回转换。为了研究静止RGLs（radial glia-like cells，即成体神经干细胞）转变为激活状态是否需要Arginase-II，作者使用BrdU标签保留测定法对静止RGLs进行标记，然后敲除Arginase-II，并在30天后分析小鼠。定量结果表明，cKO和WT小鼠的BrdU⁺细胞数和保留BrdU的RGLs无显著差异（图2）。这些发现表明，Arginase-II的缺失不会导致静息态RGLs的过早激活，因为这将导致BrdU稀释。

图2. Arginase-II的缺失不会导致静息态RGLs的过早激活

（图源：Xu ,MY. et al., EMBO J, 2023）

为了确定激活的RGLs恢复静止是否需要Arginase-II，作者评估了退出细胞周期的细胞。作者首先敲除了Arginase-II，然后进行BrdU标签保留试验。量化结果显示，cKO小鼠中保留BrdU的RGLs数量显著减少，这表明Arginase-II缺乏导致更少的激活RGLs恢复到静止状态。为了直接评估Arginase-II对激活RGLs恢复静止的需求，作者通过检查BrdU和Ki67的标记，确定了24小时后退出细胞周期的RGLs的比例。定量结果显示，WT小鼠中BrdU⁺Ki67⁺ RGLs占总RGLs的比例显著降低，KO小鼠中BrdU⁺Ki67⁺ RGLs的表达高于WT对照组（图3）。因此，这些数据表明Arginase-II是驱动激活的RGLs返回静息态所必需的。

图3. Arginase-II的缺失导致再次进入细胞周期的细胞比例增多

（图源：Xu ,MY. et al., EMBO J, 2023）

一旦RGLs被激活，大多数的RGL进行有限的增殖活动，然后分化，最终随着时间的推移而耗尽。由于Arginase-II的敲除会导致神经干细胞的过度激活，作者接下来评估了Arginase-II敲除小鼠中的神经干细胞库。作者发现，无论在KO小鼠还是cKO小鼠中，都可以看到干细胞库的下降和成体神经发生的下降。这表明Arginase-II敲除导致NSC过度激活会导致其神经干细胞库随着年龄的增长而耗尽。

为了研究Arginase-II敲除调节RGLs过度激活的潜在机制，作者从Arginase-II-KO和WT小鼠中分离出成体神经干/祖细胞（aNPCs）。体内和体外结果都显示出KO小鼠中L-精氨酸浓度的升高。作者在体内和体外模拟了高浓度的精氨酸水平，发现可以显著增加神经干细胞的增殖率（图4）。

图4. 高浓度的精氨酸水平可以导致神经干细胞的过度激活

（图源：Xu ,MY. et al., EMBO J, 2023）

为了研究由于精氨酸水平升高，引起RGLs过度活化的分子机制，作者利用一种无偏见的生化筛选方法：药物亲和反应靶稳定性分析（DARTs）。作者筛选到了与L-arginine结合的己糖激酶（HK1）。通过WB和SPR（表面等离子共振分析）实验，作者验证了L-arginine确实可以结合HK1。而在WT和KO的aNPCs中，HK1的蛋白表达水平相当，酶活性无显著差异（图5）。这些数据表明精氨酸与HK1的结合不影响其在成体神经干细胞中的稳定性和酶活性。

图5. 精氨酸与HK1结合不影响成体神经干细胞的稳定性和酶活性

（图源：Xu ,MY. et al., EMBO J, 2023）

HK1有一个N端疏水结构域，允许它通过与线粒体电压依赖性阴离子通道1(VDAC1)的可逆相互作用与线粒体外膜结合。为了评估Arginase-II敲除引起的精氨酸水平升高是否会影响HK1与线粒体的附着，作者进行了aNPCs的亚细胞器分离，并将它们分为细胞溶质部分和线粒体部分。量化结果表明，与WT-aNPCs相比，KO-aNPCs在线粒体部分中HK1蛋白的表达水平较低，但在胞质溶胶中的表达水平较高。后续，作者又通过免疫共沉淀（Co-IP）实验和邻位连接实验（PLA）证明，精氨酸浓度的升高会抑制HK1与线粒体外膜上的VDAC1的互作，并影响HK1附着到线粒体上。

一旦附着在线粒体上，HK1就可以优先使用新合成的ATP，从而提高葡萄糖使用效率。鉴于Arginase-II敲除导致精氨酸水平升高，导致HK1与线粒体的附着受到抑制，作者研究了糖酵解是否在KO-aNSCs中受到影响。通过使用Seahorse代谢分析仪测量细胞外酸化率(ECAR)，作者发现与WT-aNPCs相比，KO-aNPCs的糖酵解功能显著降低（图6），这表明Arginase-II敲除导致精氨酸水平升高，从而导致aNSCs糖酵解功能降低。通过稳定性同位素标记和耗氧量（OCR）的测定，作者发现OCR的增加是糖酵解下降的一种代偿反应（图6）。当过表达HK1 N末端的15个保守的氨基酸序列的短肽（NHK1）时，这个短肽（NHK1）会与内源的HK1竞争结合线粒体，也可以得到在KO中类似的一系列表型。得到的这些数据表明:HK1从线粒体外膜上脱落可以诱导成体神经干细胞将能量代谢从糖酵解转变为氧化磷酸化。

图6. Arginase-II的敲除可以诱导代谢从糖酵解转变为氧化磷酸化

（图源：Xu ,MY. et al., EMBO J, 2023）

然而，通过小分子药物（IACS-010759）选择性抑制氧化磷酸化可使过度激活的神经干细胞恢复静止，恢复Arginase-II敲除小鼠的异常成体神经发生。

图7 工作总结图：Arginase-II介导的精氨酸代谢在成体神经干细胞活化中的作用

（图源：Xu ,MY. et al., EMBO J, 2023）

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，该研究揭示了Arginase-II介导的精氨酸代谢在成体神经干细胞活化中的作用，从而系统阐明Arginase-II突变导致的精氨酸累积影响成体神经发生的作用机理（图7）。当Arginase-II敲除后，会引起细胞内L-精氨酸水平的累积，从而诱导HK1从线粒体外膜上脱落，造成细胞糖酵解水平的下降，氧化磷酸化水平的升高，最终引起成体神经干细胞过度激活，其神经干细胞库随着年龄的增长而耗竭。然而，该研究还有一些未解答的科学问题。比如，基因敲除的老鼠是否存在行为学的异常。总而言之，研究成果将有助于解析精氨酸血症所导致神经系统紊乱的致病机制，并为此疾病的预防和治疗提供理论基础。

原文链接：https://doi.org/10.15252/embj.2022112647

中国科学院遗传与发育生物学研究所郭伟翔课题组博士研究生徐铭悦为该论文第一作者，郭伟翔研究员为本文通讯作者。该工作得到了国家重点研究发展计划、国家自然科学基金的支持。

郭伟翔团队致力于神经干细胞和神经发生的细胞分子机制研究，以及它们在神经退行性疾病和神经发育疾病的发生机制，从而为这些疾病的预防和治疗提供理论依据。近五年来在Cell Stem Cell、Nature Communication、Neuron、Molecular Psychiatry、Cell Reports、Journal of Cell Biology、Journal of Neuroscience等杂志发表多篇论文。

郭伟翔研究员（左），通讯作者；徐铭悦（右），第一作者

（照片提供自：郭伟翔课题组）

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【1】Deng W, Aimone JB, Gage FH (2010) New neurons and new memories: how does adult hippocampal neurogenesis affect learning and memory? Nat Rev Neurosci 11: 339 – 350【2】Bond AM, Ming GL, Song H (2015) Adult mammalian neural stem cells and neurogenesis: five decades later. Cell Stem Cell 17: 385 – 395【3】Denoth-Lippuner A, Jessberger S (2021) Formation and integration of new neurons in the adult hippocampus. Nat Rev Neurosci 22: 223 – 236【4】Faigle R, Song H (2013) Signaling mechanisms regulating adult neural stem cells and neurogenesis. Biochim Biophys Acta 1830: 2435 – 2448【5】Li Y, Guo W (2021) Neural Stem Cell Niche and Adult Neurogenesis. Neuroscientist 27: 235 – 245【6】Shin J, Berg DA, Zhu Y, Shin JY, Song J, Bonaguidi MA, Enikolopov G, Nauen DW, Christian KM, Ming GL et al (2015) Single-cell RNA-Seq with waterfall reveals molecular cascades underlying adult neurogenesis. Cell Stem Cell 17: 360 – 372

本文完