Cell Biosci︱患者来源的癫痫相关LGI1突变通过调节Kv1.1增加癫痫易感性

撰文︱魏建设，沈颖

责编︱王思珍，方以一

编辑︱王思珍

癫痫是一种以反复发作为特征的常见大脑疾病，影响着1-2%的人口。目前，抗癫痫药物的治疗效果不尽人意。这表明进一步开发新的治疗靶点、阐明癫痫发病的分子机制具有着重要的研究意义。

常染色体显性侧颞叶癫痫（autosomal dominant lateral temporal epilepsy，ADLTE）是一种由富含亮氨酸的胶质瘤失活1（leucine-rich glioma inactivated 1，LGI1）基因突变引起的遗传综合征[1-3]。当前研究表明，功能性LGI1存在与兴奋性神经元、中间神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞中，并通过与去整合素和金属蛋白酶（a distintegrin and metalloproteinases，ADAMs）结合，调控K_v1的活性和AMPA型谷氨酸受体介导的突触传递[4-6]。增强LGI1-ADAM22复合物和PSD-95家族蛋白之间的相互作用可能预防癫痫，使用celecoxib恢复K_v1活性，改善了LGI1敲除小鼠的癫痫易感性[7]。临床在家族性ADLTE患者中发现了＞40个LGI1突变，突出了基因突变-细胞行为关系在个体基础上的重要性，同时增加了治疗的复杂性[13]。然而，这些LGI1突变是如何导致ADLTE患者不同的疾病表型尚不清楚。

2023年2月20日，河南大学生命科学学院魏建设团队和浙江大学医学院附属邵逸夫医院陈炜团队、沈颖团队在《细胞与生物科学》（Cell & Bioscience）发表了题为“A patient-derived mutation of epilepsy-linked LGI1 increases seizure susceptibility through regulating Kv1.1”的研究论文，描述了一种新型分泌缺陷型LGI1改变神经元兴奋性的作用，揭示了LGI1突变相关癫痫病理中的新机制。（拓展阅读：魏建设课题组研究进展，详见“逻辑神经科学”报道：J Neuroinflammation 综述︱魏建设课题组聚焦帕金森病中小胶质细胞与T细胞的相互作用对疾病进程的影响）

一、一种新的错义LGI1突变产生一种分泌缺陷的LGI1蛋白

作者通过对一名16岁复发性癫痫的中国男性患者进行血液样本全外显子组测序，对比了ExAC、dbSNP、1000G、gnomAD数据库后，确定了一个新错译LGI1变体c.547 T(p.Trp183Arg)。该变体符合常染色体显性遗传模式。为表征这种错译突变，作者通过生成野生型LGI1^WT和突变体LGI1W^183R质粒，并转染至HEK细胞中进行分析。发现LGI1W^183R突变会导致分泌缺陷，但不影响LGI1的降解。

图1 LGI1W^183R突变的遗传和表达分析

二、兴奋性神经元中表达LGI1W^183R导致癫痫发作

为了验证LGI1^W183R突变的致病机制是否依赖与兴奋性神经元。作者首先构建了一种仅在兴奋性神经元中表达外源性LGI1^WT-GFP或LGI1W^183R-GFP的cKO或Het小鼠，并对其进行自主或PTZ诱发的癫痫发作和脑电图进行视频监控。发现与Het::LGI1^WT小鼠相比，Het::LGI1^W183R小鼠的癫痫发作严重程度明显更高，提示与LGI1^WT相比，在兴奋性神经元表达LGI1^W138R会增强PTZ诱发的癫痫发作严重程度。

图2 在兴奋性神经元中表达LGI1^W183R会增加癫痫发作的易感性

三、LGI1^W183R导致海马锥体神经元过度兴奋和放电不规则

为了研究LGI1^W183R调节神经元活动的机制，作者对17-20天的cKO::LGI1^WT和 cKO::LGI1^W183R 小鼠的海马 CA1 锥体神经元进行了全细胞记录。发现随着时间的推移，cKO::LGI1^WT和cKO::LGI1^W183R神经元的尖峰变宽；但这个比率在cKO::LGI1^W183R神经元中总是比在cKO::LGI1^WT神经元中大，解释了大电流刺激时尖峰数量的减少。此外，作者同时发现AHP在cKO::LGI1^W183R神经元的第二个和第三个尖峰中降低，但随着时间的推移差异逐渐减小，提示改变的AHP可以解释cKO::LGI1^W183R神经元自发尖峰的不规则性。

图3 表达 LGI1^W183R的海马神经元的过度兴奋和尖峰不规则性

四、K_v1.1活性在cKO::LGI1^W183R神经元中下调

接下来，作者在表达LGI1^WT-GFP或LGI1^W183R-GFP的cKO海马神经元中进行了全细胞记录。通过对神经元施加一系列阶跃电压脉冲，发现cKO::LGI1^W183R神经元中的K_v1.1电流总体下降，提示LGI1^W183R抑制K_v1.1电流。通过动力学分析，发现LGI1^W183R表达减少了活性K_v1.1通道的数量，而单通道电导未受影响。为验证抑制Kv1.1是否可以抵消cKO::LGI1^WT和cKO::LGI1^W183R神经元内在兴奋性的差异，通过动力学分析表明，cKO::LGI1^WT神经元的DTx-K均提高了ISI频率、CV和CV₂值，而cKO::LGI1^W183R神经元的这些参数没有改变，从而消除了两组之间的差异。综上所述，K_v1.1活性的降低是表达 LGI1^W183R的cKO神经元异常兴奋性的原因。

图4 cKO::LGI1^W183R神经元中K_v1.1活性的下调

五、恢复K_v1.1可减轻cKO::LGI1^W183R小鼠的癫痫易感性

为探究恢复K_v1.1是否可以改善由LGI^W183R表达导致的癫痫发作和寿命缩短。构建LGI1^W183R和K_v1.1作为外源蛋白同时在cKO和Het小鼠兴奋性神经元中表达的小鼠，并通过电生理记录模型小鼠自主或PTZ诱发的癫痫发作。cKO::LGI1^W183R::mCherry 小鼠在21天之前死亡（中位寿命：22天）。相比之下，cKO::LGI1^W183R:: K_v1.1动物在此期间后存活（中位寿命：29天）。同时，视频监控显示cKO::LGI1^W183R:: K_v1.1小鼠的癫痫发作显着减少。此外，作者还检测了Het::LGI1^W183R:: K_v1.1和 Het::LGI1^W183R::mCherry小鼠中 PTZ 诱发的癫痫发作，发现 Het::LGI1^W183R:: K_v1.1小鼠的癫痫发作严重程度明显降低。提示恢复K_v1.1可减轻癫痫发作的易感性并延长 cKO::LGI1^W183R小鼠的寿命。

图5 K_v1.1恢复后癫痫易感性降低

六、通过表达K_v1.1恢复cKO::LGI1^W183R神经元兴奋性

为探究恢复K_v1.1是否可以逆转表达LGI1^W183R的神经元受损的固有兴奋性从而减少癫痫发作。通过对cKO::LGI1^W183R小鼠的兴奋性神经元中表达K_v1.1，并进行了神经元进行全细胞记录和动力学分析。发现表达K_v1.1有效地恢复了cKO::LGI1^W183R神经元中K_v1.1电流，提示表达K_v1.1可以挽救K_v1.1电流的缺陷激活和失活。此外，Kv1.1挽救了 cKO::LGI1^W183R 神经元中快速AHP的缺陷。总的来说，恢复K _v1.1可以挽救 cKO::LGI1^W183R神经元中受损的 AP动力学和放电模式。

图6 恢复K_v1.1可以挽救神经元的兴奋性

文章结论与讨论，启发与展望

作者在一个患有ADLTE的中国家庭中发现了一个新的LGI1致病变异，扩大了LGI1致病变异的范围，揭示了p.Trp183Arg错义突变在癫痫发作中表现出的致病机制，表明该突变产生分泌缺陷型LGI1^W183R蛋白，导致兴奋性神经元过度兴奋和放电不规则，并通过下调K_v1.1导致小鼠癫痫发作活动。此外，恢复兴奋性神经元中的K_v1.1能够纠正放电的缺陷并改善癫痫发作的易感性。因此，该工作揭示了一种新机制：分泌缺陷型LGI1蛋白可通过该机制导致神经元功能障碍和家族性癫痫。

原文链接：https://cellandbioscience.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13578-023-00983-y

浙江大学医学院附属邵逸夫医院周琳，浙江大学第一附属医院王康，河南大学徐煜翔为该论文的共同第一作者，浙江大学医学院附属邵逸夫医院陈炜、沈颖，河南大学生命科学学院魏建设共为本文通讯作者。该研究受国家基金委国家杰青项目、重点国际合作项目、面上项目、科技部重点研发项目等资助。

魏建设（左），沈颖（中），陈炜（右）。

（照片提供自：魏建设，沈颖，陈炜）

通讯作者简介（上下滑动查看）  

魏建设，教授, 黄河学者。河南大学脑科学研究所所长。从事神经变性疾病基础与转化研究，重要成果在Neuron, Nat Commun, J Neuroinflammation, AJP, JBC等发表。承担国家基金委面上与国际合作重点、河南自然科学基金等项目；为中国老年医学会抗衰老分会委员、神经修复专委会委员，河南神经科学学会副理事长、河南生物物理学会理事，河南感染免疫专委会副主任委员等。Email: [e-mail]

沈颖，国家杰青，浙江大学求是特聘教授，教育部新世纪优秀人才。主持973项目、国家重点研发计划、国家重大科学研究计划、国家自然科学基金、浙江省自然科学基金人才/重点等项目，发现了影响神经信息传递、整合和功能的多个重要分子和机制，通讯和第一作者论文发表在Nat Neurosci、Neuron、PNAS、J Neurosci等。实验室长期招聘博士后，联系[e-mail]。

陈炜，二级岗主任医师。长期从事精神疾病的临床研究。获得国家重点研发计划课题、浙江省重点研发计划和国家自然科学基金的支持。担任教育部高等学校精神医学专业教学指导委员会委员，中国老年学与老年医学学会精神卫生分会副主任委员，中华医学会心身医学分会常委，浙江省医学会心身医学分会主任委员、精神病学分会侯任主任委员。

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2.Bisulli F, Tinuper P, Scudellaro E, Naldi I, Bagattin A, Avoni P, et al. A de novo LGI1 mutation in sporadic partial epilepsy with auditory features. Annals Neurol. 2004;56:455–6.

3.Furlan S, Roncaroli F, Forner F, Vitiello L, Calabria E, PiquerSirerol S, et al. The LGI1/epitempin gene encodes two protein isoforms differentially expressed in human brain. J Neurochem. 2006;98:985–91.

4.Schulte U, Thumfart JO, Klocker N, Sailer CA, Bildl W, Biniossek M, et al. The epilepsylinked Lgi1 protein assembles into presynaptic Kv1 channels and inhibits inactivation by Kvbeta1. Neuron. 2006;49:697–706.

5.Seagar M, Russier M, Caillard O, Maulet Y, FronzaroliMolinieres L, De San FM, et al. LGI1 tunes intrinsic excitability by regulating the density of axonal Kv1 channels. Proc Natl Acad Sci USA. 2017;114:7719–24.

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7. Lovero KL, Fukata Y, Granger AJ, Fukata M, Nicoll RA. The LGI1ADAM22 protein complex directs synapse maturation through regulation of PSD 95 function. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112:E4129–37. 

本文完