Life Med | 田勇/宋国旭通过人小脑3D类器官揭示脊髓小脑共济失调症发病机制

脊髓小脑共济失调（Spinocerebellar ataxia，SCA）是显性遗传性中枢神经系统退行性疾病，到目前为止有40多种亚型。SCA拥有相似的临床表现以及神经退行性特征，病理学研究显示其损害的主要部位是小脑(Schols et al., 2004)。脊髓小脑共济失调3型（Spinocerebellar ataxia type 3，SCA3）又称马查多-约瑟夫病(Machado-Joseph disease，MJD), 是脊髓小脑共济失调症最常见的类型。SCA3发病是由于14号染色体上ATXN3等位基因编码区胞嘧啶-腺嘌呤-鸟嘌呤（CAG）三核苷酸重复序列异常扩增引起的(Sudarsky and Coutinho, 1995)。健康个体CAG重复数为13~43次，而患者中CAG重复数在52~86次之间(Costa Mdo and Paulson, 2012; Evers et al., 2014)。尽管SCA3疾病被广泛研究，但其发病的细胞和分子机制还知之甚少，目前尚无有效的医学手段可以治愈。

2022年6月，中国科学院生物物理研究所田勇课题组在Life Medicine杂志在线发表了题为CRISPR/Cas9-mediated Genetic Correction Reverses Spinocerebellar Ataxia 3 Disease-associated Phenotypes in Differentiated Cerebellar Neurons的研究论文。研究人员利用CRISPR-Cas9基因编辑技术成功地对SCA3疾病的诱导多能干细胞系（induced pluripotent stem cells, iPSCs）进行了基因修复，获得了SCA3基因修复的iPSCs。并在体外进行了小脑3D类器官培养，建立了小脑特异性的神经干细胞和神经元细胞模型，探索了SCA3疾病的发病机理。

CRISPR-Cas9基因修复扭转SCA3疾病相关表型

首先，研究人员分离并培养了SCA3病人来源的肾小管上皮细胞，通过细胞重编程技术建立了两株SCA3疾病的iPSCs细胞系（Pa1-SCA3和Pa2-SCA3 iPSCs）。经测序分析确定，这两株细胞系的ATXN3 基因CAG重复区域均存在异常扩增现象。Pa1-SCA3和Pa2-SCA3 iPSCs突变的ATXN3等位基因中分别包含80和78个CAG重复，而其正常的等位基因则分别包含23和13个CAG重复。为了修复SCA3 iPSCs，研究人员针对ATXN3 基因第10号外显子，设计了双gRNA靶向的一步基因修复策略。在提供修复模板的情况下，通过同源重组的修复方式，将突变区域80个CAG重复修复为13个CAG重复，从而获得基因修复的iPSCs。

由于小脑是SCA3疾病影响的主要区域，研究人员将SCA3疾病和基因修复的iPSCs，在体外进行了小脑3D类器官分化，并首次有效建立了小脑特异性的神经干细胞和神经元细胞模型。分化的小脑3D组织以及细胞模型，表达小脑发育各时期特异性标志物，包括小脑上皮组织标志物：GBX2和KIRREL2，浦肯野前体标志物：L7和CALB1，以及小脑颗粒细胞标志物：ATOH1和PAX6。这些小脑区域特异性的细胞不仅提供了有效的模型以研究SCA3疾病的发病机制，而且还可以用于SCA3疾病的细胞治疗和药物筛选，显示出了广阔的应用前景。

小脑3D类器官，神经干细胞和神经元细胞模型的建立

随后研究人员通过TUNEL，BRDU等技术手段分析了SCA3基因修复前后细胞的各种表型变化。研究发现，基因修复过后，细胞的增殖能力恢复至正常水平。SCA3 神经干细胞和神经元更容易受环境影响而凋亡。另外，通过Western blot方法发现，SCA3基因修复后，细胞的发病进程被扭转。SCA3疾病小脑神经元会形成自发性的ataxin-3蛋白聚集体，而基因修复过后，这一标志性的疾病进程被改变，聚集体消失。其他类型细胞，如SCA3 iPSCs细胞系，SCA3 NSCs，以及SCA3泛神经元均不会形成自发性的ataxin-3蛋白的聚集体。

总之，该研究建立了SCA3 疾病的iPSCs细胞系并成功将ATXN3突变基因进行了修复。在体外利用小脑3D类器官培养的方法获得了小脑特异性的神经干和神经元细胞，为探索SCA3疾病的发病机制提供了有效的细胞模型。重要的是，SCA3基因修复的小脑神经元没有显示出典型的ataxin-3蛋白聚集体，这表明基因修复可以随后逆转 SCA3 疾病的进展。 该策略也可以应用于其他三核苷酸重复疾病，以促进疾病建模、机制研究和药物发现等的研究。

中国科学院生物物理研究所田勇研究员和宋国旭助理研究员和为本文的共同通讯作者，宋国旭为本文的第一作者。该研究得到国家自然科学基金、科技部重点研发计划和中科院先导专项的经费支持。

参考文献：

Song G., Ma Y., Gao X., Zhang X., Zhang F., Tian C., Hou J., Liu Z., Zhao Z. andTian Y. (2022). CRISPR/Cas9-mediated Genetic Correction Reverses Spinocerebellar Ataxia 3 Disease-associated Phenotypes in Differentiated Cerebellar Neurons. Life Medicine. DOI: 10.1093/lifemedi/lnac020.

Costa Mdo, C., and Paulson, H.L. (2012). Toward understanding Machado-Joseph disease. Progress in neurobiology 97, 239-257.

Evers, M.M., Toonen, L.J., and van Roon-Mom, W.M. (2014). Ataxin-3 protein and RNA toxicity in spinocerebellar ataxia type 3: current insights and emerging therapeutic strategies. Molecular neurobiology 49, 1513-1531.

Schols, L., Bauer, P., Schmidt, T., Schulte, T., and Riess, O. (2004). Autosomal dominant cerebellar ataxias: clinical features, genetics, and pathogenesis. The Lancet Neurology 3, 291-304.

Sudarsky, L., and Coutinho, P. (1995). Machado-Joseph disease. Clinical neuroscience 3, 17-22.

原文链接：https://doi.org/10.1093/lifemedi/lnac020

作者简介

宋国旭

中国科学院生物物理研究所

宋国旭博士于2012年在郑州大学获得生物技术学士学位，2015年和2022年在中国科学院生物物理研究所分别获得生物工程硕士和理学博士学位；2015年任职于生物物理研究所，主要研究方向为基因编辑技术的研发以及利用基因编辑技术进行疾病治疗的研究。目前以第一作者身份，在Nucleic Acids Research，Cell Reports等杂志发表多篇研究论文。

田勇

中国科学院生物物理研究所

中国科学院生物物理研究所研究员，博士生导师，中国科学院核酸生物学重点实验室课题组组长。2015年起担任中国科学院大学岗位教授，《Animal Models and Experimental Medicine》杂志副主编，《Mammalian Genome》杂志编委，《生物化学与生物物理学进展》杂志常务编委。近五年以来以通讯作者/共通讯作者身份在Immunity (2022), Cell Research (2022, 2020) , Neuron (2022), Nature Immunology (2019, 2018, 2017, 2016), Nucleic Acids Research (2022), Molecular Cancer (2021)，Journal of Hepatology (2018), Nature Communications (2021, 2020, 2019, 2018, 2017), Cellular & Molecular Immunology (2022，2021), Journal of Experimental Medicine (2019a，2019b), The EMBO Journal (2020, 2019, 2018)，Cell Reports (2019)等国际一流学术刊物上发表多篇研究论文。

制版：陆小炮

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