Nat Commun | 林森杰团队揭示胰蛋白酶介导调控浮游植物氮磷营养盐平衡的新机制

作者︱尤燕春

责编︱王思珍

编辑︱杨  婵

胰蛋白酶（trypsin）以动物消化系统的蛋白水解酶闻名，在动物里普遍存在，参与酶原激活、食物消化、免疫防卫等多种重要生理过程，其研究始于19世纪，但一直集中在动物领域，认为不存在于植物与藻类中[1]。林森杰课题组在对2014年发生于中国东海的一次赤潮的研究中发现硅藻拥有胰蛋白酶基因，且其表达量在甲藻赤潮爆发前、水体中磷营养盐发生急剧下降的时候非常高（占硅藻总transcripts的1%）[2]，表明其在硅藻对营养条件变化响应中扮演着重要角色，但具体功能未知。

2022年7月12日，厦门大学近海海洋环境科学国家重点实验室、海洋与地球学院林森杰教授率领其海洋分子生态与基因组学研究团队（MEG）在Nature Communications上发表了题为“Trypsin is a coordinate regulator of N and P nutrients in marine phytoplankton”的研究论文，解开了藻类trypsin功能之谜。

该研究团队基于其前期赤潮研究发现的胰蛋白酶（trypsin）可能对硅藻营养代谢有重要作用的线索，利用Tara Ocean的相关数据和藻类基因组数据库，发现trypsin在全球海洋的浮游植物各主要类群中普遍存在，同时其表达水平与环境营养盐变化相关，特别是硅藻和绿藻胰蛋白酶对氮（N）和磷（P）营养盐变化的响应尤为明显（图1）。

图1 胰蛋白酶在全球海洋浮游植物中的广泛分布及对环境营养盐的响应

（图源：You, Y. et al., Nat Commun, 2022）

该研究进一步以三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）为模式生物，开展海洋浮游植物胰蛋白酶的功能研究，发现三角褐指藻胰蛋白酶基因2（PtTryp2）在细胞对数生长期显著高表达，并受到氮限抑制表达表达，和磷限诱导表达（图2）。此外，PtTryp2转录本还随着胞内N的增加而增加，但随着胞内P的增加而减少（图2）。这些结果表明，PtTryp2对硅藻细胞生长和响应营养盐胁迫具有重要的调控作用，是氮磷营养协同利用的一个潜在双向调控元件。

图2 三角褐指藻胰蛋白酶基因PtTryp2表达水平参与响应氮磷营养盐变化

（图源：You, Y. et al., Nat Commun, 2022）

该研究综合运用CRISPR/Cas9基因编辑、转基因、过表达及亚细胞定位、RNA-seq、生理参数测定等分子生物学和细胞生物学的理论和方法，研究胰蛋白酶PtTryp2在三角褐指藻中的亚细胞定位和PtTryp2基因被敲除或过表达后藻细胞在不同营养盐条件下的生理响应、基因表达谱及重要代谢途径变化。该研究通过转基因技术把构建好的表达eGFP-PtTryp2融合蛋白的载体转到三角褐指藻细胞，并利用Western Blot验证蛋白水平的表达（图3a）。利用获得的过表达突变株结合荧光共聚焦显微镜观察，发现PtTryp2定位在叶绿体，而叶绿体被证实是很多营养盐代谢与同化的主要部位（图3b）。

图3 PtTryp2的过表达验证及亚细胞定位

（图源：You, Y. et al., Nat Commun, 2022）

该研究进一步利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功获得3株不同基因型的PtTryp2敲除株，通过比较分析不同突变株在不同氮磷培养条件下的相关生理参数结合转录组数据发现，PtTryp2基因敲除导致大多数氮同化和代谢基因在缺氮和富氮条件下上调（图4a）。PtTryp2敲除后显著增加细胞对硝酸盐的吸收，并提高胞内氮含量。相反的，PtTryp2过表达则显著抑制细胞对硝酸盐的吸收，并降低胞内氮含量（图4b，4c）。此外，在对照中发现了646个对氮限响应的差异表达基因，但在敲除株中只有187个。并且，大多数DEGs（73%）在PtTryp2-KO1中的变化幅度小于KOC（图4d，4e）。表明，PtTryp2在野生型中的功能是通过抑制氮同化和新陈代谢，作为对N-饥饿的全局代谢反应的放大器。

图4 PtTryp2抑制氮的同化和代谢

（图源：You, Y. et al., Nat Commun, 2022）

该研究还发现在对照株，大多数Pi转运体（PTs）和碱性磷酸酶（APs）对P饥饿响应表现出上调，但大多数SPX基因表现出下调（图5a）。在磷限下，PtTryp2敲除则下调了大部分Pi转运体和碱性磷酸酶的表达，但上调了大部分SPX基因（图5a），揭示了PtTryp2在WT中促进磷饥饿诱导基因表达的作用。PtTryp2敲除后显著抑制细胞对磷酸盐的吸收，并降低胞内磷含量（图5b）。相反的，PtTryp2过表达则显著促进细胞对磷酸盐的吸收，并提高胞内磷含量（图5c）。此外，在对照中发现了277个对磷限响应的差异表达基因，但在敲除株中有1501个（图5d）。并且，大多数DEGs（77.25%）在PtTryp2-KO1中的变化幅度大于KOC（图5e）。表明，PtTryp2在野生型中的功能是通过促进磷饥饿诱导基因表达，缓解细胞对磷饥饿的全局响应。

图5 PtTryp2促进磷饥饿诱导基因的表达和Pi吸收

（图源：You, Y. et al., Nat Commun, 2022）

该研究揭示了PtTryp2通过两个层级施展其对N、P营养吸收的双向耦联调控。首先，PtTryp2的功能是抑制N吸收的同时促进P吸收。其次，细胞通过调整PtTryp2的表达水平实现对N、P营养变化的协同响应：当环境N营养匮乏时，细胞内PtTryp2表达下调，结果增进N营养吸收，同时减少P吸收，以保持细胞内N:P比例相对稳定；相反，当环境P营养匮乏时，细胞内PtTryp2表达上调，促进P吸收但减少N吸收，维持细胞内N:P比例相对稳定。如此，PtTryp2响应细胞内营养盐状态而通过调节自身的基因表达水平来应对营养盐变化，通过新陈代谢调节，减小N-P平衡这个“跷跷板”的振幅，达到促进不同营养盐的协同利用及维持胞内营养盐化学计量比稳态（图6）。

图6 胰蛋白酶介导调控细胞氮磷平衡示意图

（图源：You, Y. et al., Nat Commun, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，基于以上系列实验数据，研究者发现以动物消化酶被发现并早期认为在藻类和植物中不存在的胰蛋白酶，不仅普遍存在于全球海洋的浮游植物各主要类群，同时其表达水平与环境营养盐变化相关，进一步发现其介导调控细胞氮磷平衡。这些发现更新了我们对这种古老酶分布的认识，揭示了胰蛋白酶的新功能，为深入研究浮游植物对营养环境变动的响应与适应机制提供新方向，揭示了海洋浮游植物胰蛋白酶介导的氮磷协同利用的新机制，为海洋浮游植物响应和适应日趋失衡的环境营养盐变化的调控机理提供新见解，为构建完善预测未来增温引起的大洋寡营养化与人类排放引起的近海富营养化如何影响浮游植物群落结构与功能的生态模型提供理论基础。然而，胰蛋白酶介导的氮磷协同调控级联中的许多机制仍有待阐明，比如胰蛋白酶如何感知传导环境营养盐信号变化，并如何作用调控N和P相关的下游基因等等，都需要进一步研究。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-022-31802-6

厦门大学近海海洋环境科学国家重点实验室、海洋与地球学院林森杰教授为论文的通讯作者，其带领的海洋分子生态与基因组学研究团队的尤燕春博士为论文第一作者，厦门大学近海海洋环境科学国家重点实验室李凌高级工程师、博士生马明雷、博士生何佳敏、硕士生孙雪琼和美国康涅狄格大学博士生Felipe Wendt Porto参与了该项工作。该工作得到国家自然科学基金青年项目（41906123）、中国科学院海洋生态与环境科学重点实验室（中国科学院海洋研究所）开放基金（KLMEES202006）、山东省重大科技创新工程专项（2018SDKJ0406-3）、厦门大学近海海洋环境科学国家重点实验室自主课题（MELRI2105）和美国Gordon and Betty Moore Foundation项目（4980.01）的资助。

林森杰团队全家福

（照片提供自：厦门大学近海海洋环境科学国家重点实验室、海洋与地球学院）

通讯作者简介：

林森杰教授，长期致力于浮游植物生态学和生态基因组学研究，其带领的海洋分子生态与基因组学研究团队（MEG）以分子生物技术和现代组学分析方法为手段，致力于浮游植物营养生态、有害藻华形成机制、共生生物学等的研究。其先后主持和参与国家自然科学基金重点项目，国家重点研发项目等国家级项目。已在Science, Nature Methods, Nature Communications, PNAS等顶尖学术刊物上发表论文200余篇。历任《Journal of Phycology》，《Frontiers in Microbiology》，《Frontiers in Marine Science》等SCI学术期刊副编委或编委。

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参考文献：

[1] Rojas A. & Doolittle RF. The occurrence of type S1A serine proteases in sponge and jellyfish. Journal of molecular evolution 55, 790-794 (2002).

[2] Zhang Y, Lin X., Shi X., Lin L., Luo H., Li L., & Lin S. Metatranscriptomic signatures associated with phytoplankton regime shift from diatom dominance to a dinoflagellate bloom. Frontiers in microbiology 10, 590 (2019).

本文完