Mol Ther︱高宗良等构建缩短版的先导编辑器，助力先导编辑系统体内呈递

作者︱高宗良

责编︱王思珍

编辑︱杨   婵

先导编辑器（prime editor, PE）一种基于CRISPR-Cas9的一种新型基因编辑工具[1]。PE可以在避免DNA双链断裂的情况下实现任意碱基替换、DNA片段插入和缺失，因此在基础科学研究和遗传病治疗方面有着巨大潜力。然而PE的编码基因太长（>6.4 kb）使得通过病毒载体进行装载及体内递送十分困难。例如，在基因治疗领域流行的腺相关病毒载体(AAV)的装载极限约4.7 kb。因而解决PE的体内呈递难题对于其广泛的应用非常重要。

2022年7月7日，奥胡斯大学高宗良所在科研团队在Molecular Therapy上发表了题为“A truncated reverse transcriptase enhances prime editing by split AAV vectors”的研究。该研究通过对PE进行一系列改造，构建了一个缩短版的PE，并通过双AAV将缩短版的PE呈递到小鼠体内实现基因编辑，为将来更加广泛的体内研究打下基础。

PE是由单突变的Cas9和一个逆转录酶（reverse transcriptase，RT）构成。目前对Cas9的结构等方面已较为详细的研究，因此本文作者针对RT展开了一系列探究。作者首先在细胞水平验证了来11个自于不同物种的RT变体，通过替换掉PE当中的RT，发现只有一个变体能够介导有活性的PE，但其活性非常低（图1B）。作者进一步对RT进行密码子优化，发现可将PE的表达量提高1.4倍（图1C），构建了PE^CO，并证明PE^CO比PE有着更高的先导编辑效率（图1D&E），因此PE^CO被用于接下来的研究。

图1 RT变体筛选和密码子优化

（图源：Gao Z, et al., Mol Ther, 2022）

先导编辑系统需要利用RT的反转录酶活性来合成预先设计的编辑序列，而RT是由DNA聚合酶和核糖核酸酶H（RNase H）两个结构域构成，作者猜测PE^CO只需要RT的聚合酶功能而不需要RNase H域。通过删除RT的RNase H 结构域（RT-∆R），作者发现含有RT和RT-∆R的PE^CO介导相同的先导编辑效率（图2A&D），提示RNase H对PE是非必须的这一猜想是正确的。该研究在RT^CO-∆R的基础上进行更为精确的缩短，通过一些列突变体筛选得到了了一个含有极限缩短RT的PE^CO（PE^CO-Mini）（图2B&C）。与PE^CO相比， PE^CO-Mini缩短了621 bp并介导相同的先导编辑效率。

图2 通过截短RT构建缩短版PE。说明：图2&1重复，正确图2请参考原文

（图源：Gao Z, et al., Mol Ther, 2022）

如上所述，PE^CO和PE^CO-Mini超出了单个AAV的装载上限而不能呈递PE。为了实现AAV呈递PE^CO，作者借助于可以介导蛋白质剪切的内含肽（intein）（图3A）。内含肽可以通过介导蛋白质剪切而将两个蛋白融合到一起，从而实现大分子量蛋白的呈递。例如，借助于内含肽，单碱基编辑器（base editor）可以被分到两个AAV中从而实现有效递[2]。作者对两种内含肽（Npu和Rma）和四个Cas9分裂位点的组合进行筛选，发现Rma结合573/4和674/5分裂位点能够介导最高的先导编辑效率（图3B）。然而如果使用573/4或者674/5分裂位点将PE^CO一分为二，其N端部分的编码基因大小仍超出了AAV的装载上限，但是PE^CO-Mini能够允许使用上述两个分裂位点而不引起AAV包装问题。数据显示，使用PE^CO-Mini的AAV载体其病毒滴度要比PE^CO高5倍，并且介导更高的先导编辑（图3E, F）。

图3 PECO-Mini加强双AAV的呈递

（图源：Gao Z, et al., Mol Ther, 2022）

为了验证是否可以利用双AAV实现体内呈递PE^CO-Mini，作者选择靶向向小鼠肝脏的枯草溶菌素转化酶9（PCSK9），通过单碱基插入而敲除PCSK9（图4A）。利用Rma-573/4将PE^CO-Mini分到两个AAV8载体中，该研究将病毒通过尾部注射到小鼠体内，在四周后取其肝脏进行分析，数据显示有效的先导编辑效率达约6%（图4D）。因此，实验证明PE^CO-Mini可以通过双AAV实现有效的体内递呈和基因编辑。

图4 双AAV可实现体呈递PECO-Mini

（图源：Gao Z, et al., Mol Ther, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，该研究通过针对RT进行密码子优化和缩短，构建了一个表达量更高（1.4倍）和长度更短（621 bp）的PE^CO-Mini。通过对内含肽和分裂位点的筛选，作者得到了能够介导高效先导编辑的分裂条件。利用优化的内含肽分裂参数，PE^CO-Mini比PE^CO可以产生更高的AAV滴度和先导编辑效率。研究最后证明PE^CO-Mini能够通过双AAV8实现体内有效呈递和先导编辑效率。该研究为将来更加广泛的体内应用铺平道路。目前先导编辑的效率相对较低，未来提高其编辑效率将会极大促进PE在疾病治疗中的潜力。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2022.07.001

胡斯大学生物医学院Rasmus O. Bak教授团队高宗良博士为该论文的第一作者。

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参考文献：

[1]. Anzalone, A. V., Randolph, P. B., Davis, J. R., Sousa, A. A., Koblan, L. W., Levy, J. M., Chen, P. J., Wilson, C., Newby, G. A., and Raguram, A. (2019) Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA. Nature 576, 149-157.

[2]. Chen, Y., Zhi, S., Liu, W., Wen, J., Hu, S., Cao, T., Sun, H., Li, Y., Huang, L., and Liu, Y. (2020) Development of Highly Efficient Dual‐AAV Split Adenosine Base Editor for In Vivo Gene Therapy. Small Methods 4, 2000309.

本文完