为什么要做绝对定量测序-实验原因和实验解决策略（miRNA篇）

小RNA是生物体内一类具有重要调控功能的非编码短小RNA的总称。大量研究已经证实，小RNA几乎参与调控了动植物所有的生命过程，包括细胞增殖，分化，凋亡等，并且与人类疾病的发生发展密切相关。小RNA测序正是对这一类重要的调控小RNA——特别是microRNA（miRNA）展开分析。miRNA是一类长度在22nt左右的内源性非编码小RNA，其前体具有发夹结构，广泛存在于动物、植物、病毒等多种有机体中。miRNA通过对靶基因的降解（植物）或者翻译抑制（动物）介导转录后基因沉默，参与基因表达的调节，具有基因转录后水平调控作用。

miRNA的研究手段包括miRNA测序和miRNA芯片，其中miRNA测序整个流程如下图：

图1：miRNA测序项目流程

看到图中的PCR扩增，想必各位看官会想到PCR Duplication。是的，和转录组测序一样，由于文库构建过程中有PCR扩增过程，从而产生PCR Duplication（回顾一下什么是Duplication呢？在构建NGS测序文库时，通常要进行一定次数的PCR扩增，以满足测序所需的文库量。然而，由于扩增的偏好性以及扩增倍数的不确定性，导致各个片段被扩增的倍数是不一定相同的，这种因PCR扩增产生的重复reads即为Duplication。之前的软文已经提到PCR Duplication在转录组测序中，会对基因表达定量造成干扰，解决方案是UMI标记技术，即绝对定量转录组。因此在miRNA测序中，也需要采用绝对定量miRNA技术克服Duplication引入的定量误差（图2）。

图2 

无论是绝对定量转录组还是绝对定量miRNA，UMI的数量都要远超过表达丰度最高的转录本打断片段（mRNA）或者转录本（miRNA）（保证每个转录本打断片段/转录本都能够被唯一的UMI所标记，避免出现人为减低表达丰度。因为当同一转录本打断片段/转录本被相同的UMI标记，表达计算时会被错误的被认为是PCR Duplication），而在体细胞中，丰度最高的miRNA表达量（read数）有时会超过所测数据的40%，达到几千万read [1]，因此需要的UMI数量会比绝对定量转录组测序需要的UMI数量更多。 为了得到足够的UMI，UMI的长度需要更长，例如当长度为10bp时，UMI的数量可达到4^{10 *}4¹⁰，数量远超最高表达miRNA表达量。

由于UMI常为随机碱基序列，连续的9个随机碱基在文库扩增时容易和扩展引物随机结合，导致最后的测序数据中出现长度不均一的、长度较短的read，浪费数据量。同时miRNA鉴定的通用标准是分析序列的相似性，而成熟体miRNA长度较短，若引入的UMI序列出现插入或者缺失的情况，会对miRNA鉴定及定量造成干扰（例如当UNI出现插入或者缺失时，UMI序列去除不完整，出现人为制造的、假的miRNA序列）。为了避免这些情况出现，可以使用序列固定的UMI locator将UMI分成不同的区段，例如5′–NNN-CGA-NNN--TAC-NNN–3′（图3）。考虑到测序时需要复杂文库，UMI locator被设计成两套（图3），可以增加文库复杂度，避免测序时测序数据下降。UMI locator设计和传统UMI相比，一方面通过特定序列将连续的随机碱基分开，避免出现引物非特异性结合；另一个方面是可以区分UMI是否出现插入缺失的情况，从而更精准的对miRNA鉴定和定量。

图3：绝对定量miRNA UMI文库结构

参考文献

1、Yue F, Cheng Y, Breschi A, Vierstra J, Wu W, Ryba T, Sandstrom R, Ma Z, Davis C, Pope BD, Shen Y, Pervouchine DD, Djebali S, Thurman RE, Kaul R, Rynes E, Kirilusha A, Marinov GK, Williams BA, Trout D, Amrhein H, Fisher- Aylor K, Antoshechkin I, DeSalvo G, See LH, Fastuca M, Drenkow J, Zaleski C, Dobin A, Prieto P, Lagarde J, Bussotti G, Tanzer A, Denas O, Li K, Bender MA, Zhang M, Byron R, Groudine MT, McCleary D, Pham L, Ye Z, Kuan S, Edsall L, Wu YC, Rasmussen MD, Bansal MS, Kellis M, Keller CA, Morrissey CS, Mishra T, Jain D, Dogan N, Harris RS, Cayting P, Kawli T, Boyle AP, Euskirchen G, Kundaje A, Lin S, Lin Y, Jansen C, Malladi VS, Cline MS, Erickson DT, Kirkup VM, Learned K, Sloan CA, Rosenbloom KR, Lacerda de Sousa B, Beal K, Pignatelli M, Flicek P, Lian J, Kahveci T, Lee D, Kent WJ, Ramalho Santos M, Herrero J, Notredame C, Johnson A, Vong S, Lee K, Bates D, Neri F, Diegel M, Canfield T, Sabo PJ, Wilken MS, Reh TA, Giste E, Shafer A, Kutyavin T, Haugen E, Dunn D, Reynolds AP, Neph S, Humbert R, Hansen RS, De Bruijn M, Selleri L, Rudensky A, Josefowicz S, Samstein R, Eichler EE, Orkin SH, Levasseur D, Papayannopoulou T, Chang KH, Skoultchi A, Gosh S, Disteche C, Treuting P, Wang Y, Weiss MJ, Blobel GA, Cao X, Zhong S, Wang T, Good PJ, Lowdon RF, Adams LB, Zhou XQ, Pazin MJ, Feingold EA, Wold B, Taylor J, Mortazavi A, Weissman SM, Stamatoyannopoulos JA, Snyder MP, Guigo R, Gingeras TR, Gilbert DM, Hardison RC, Beer MA, Ren B, Mouse ENCODEC. A comparative encyclopedia of DNA elements in the mouse genome. Nature. 2014;515:355–64.

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