神秘嘉宾亲译！空间转录组样本准备指南官方说明书-Part 7（FFPE样本建库） | 空间转录组专题
空间转录组FFPE样本建库
以下实验参考10x Genomics官方文档CG000407，如有出入以官方文档为准
所需试剂盒/配件
Visium Spatial Gene Expression Slide Kit, 16 rxns PN-1000185 | 4 rxns PN-1000188
Visium Tissue Section Test Slides, 4 Pack, PN-1000347
Visium FFPE Reagent Kit, Large PN-1000362 | Small PN-1000361
Visium Human Transcriptome Probe Kit, Large PN-1000364 | Small PN-1000363
Visium Mouse Transcriptome Probe Kit, Large PN-1000366 | Small PN-1000365
Visium Accessory Kit, PN-1000194
Dual Index Kit TS Set A, 96 rxns PN-1000251
1. 探针杂交；
（1）室温下按下表准备探针杂交预备混合液（Pre-Hybridization Mix）；
（2）移去芯片盒上的封口膜；用移液枪吸去每个小孔中的TE buffer；
（3）沿小孔边沿加入100ul Pre-Hybridization Mix，使之均匀地覆盖在组织切片上，注意不要引入气泡；
（4）室温下孵育15分钟；
（5）按下表设置PCR仪参数以备后续实验；
（6）室温下按下表配置探针杂交混合液（Probe Hybridization Mix），移液枪吹打混匀10次，短离心；
（7）吸去每个小孔中的Pre-hybridization Mix；
（8）向每个小孔中加入常温的Probe Hybridization Mix；
（9）用封口膜封住芯片盒，放在PCR仪适配器上；50℃过夜。
2. 探针连接反应
2.1 探针杂交清洗；
（1）按下表准备试剂，调整至所需的温度；
（2）50℃预热FFPE Post-Hyb Wash Buffer， 每个样品需要495ul；
（3）按下表配制2X SSC Buffer；
（4）从PCR仪的适配器上取出芯片盒，将其放置在干净平整的工作台面上；
（5）揭开芯片盒上的封口膜，向每个小孔中加入150ul预热过的FFPE Post-Hyb Wash Buffer。避免蒸干或buffer降低到室温；
（6）用封口膜封住芯片盒，将其放在适配器上，盖上PCR仪的盖子；50℃孵育5min；
（7）从PCR仪的适配器上取下芯片盒，将其放置在干净平整的工作台面上；
（8）揭开芯片盒上的封口膜，吸去每个小孔中的FFPE Post-Hyb Wash Buffer；
（9）重复（6）到（8）一次；
（10）向每个小孔中加入150ul 2X SSC Buffer；
（11）让芯片盒降温到室温（~3min），然后进入下一步反应。
2.2 探针连接反应
（1）按下表设置PCR仪参数，以备后续反应；
（2）按下表准备探针连接混合液（Prepare Probe Ligation Mix），移液枪吹打混匀10次，短离心；
（3）吸去每个小孔中的2X SSC Buffer；
（4）向每个小孔沿边缘加入60ul Prepare Probe Ligation Mix，使其均匀地覆盖在每个切片上，注意不要引入气泡；手指轻拍芯片确保均匀覆盖；
（5）用新的封口膜封住芯片盒，将芯片盒放在带有适配器的预热好的PCR仪上，盖上PCR仪的盖子；37℃反应1h。
2.3 探针连接后清洗
（1）按每个样品110ul， 57℃下预热杂交连接清洗液（Post Ligation Wash Buffer）；
（2）从PCR仪适配器上取下芯片盒，将其放置在干净平整的工作台面上；
（3）按下表设置PCR仪，以备后续反应；
（4）揭开芯片盒上的封口膜，吸去每个孔中Probe Ligation Mix；
（5）向每个小孔中加入常温的Post Ligation Wash Buffer；
（6）用封口膜封住芯片盒，将其放置在PCR仪适配器上，盖上PCR仪盖子，57℃孵育5min；
（7）取下芯片盒，揭开封口膜，吸去每个小孔中的Post Ligation Wash Buffer；
（8）向每个小孔中加入常温的Post Ligation Wash Buffer；
（9）用封口膜封住芯片盒，将其放置在PCR仪适配器上，盖上PCR仪盖子，57℃孵育5min；
（10）取下芯片盒，揭开封口膜，吸去每个小孔中的Post Ligation Wash Buffer；
（11）向每个小孔中加入150ul 2X SSC Buffer（见2.1（3））；
（12）吸去每个小孔中的2X SSC Buffer；
（13）向每个小孔中加入150ul 2X SSC Buffer；
（14）使芯片温度降至室温，进行后续实验；如不立即进行实验，可用封口膜封住芯片盒，4℃保存至多24h。
3. 探针释放&延伸
3.1 RNA降解&探针释放
（1）在PCR仪上放置适配器，按照下表设置PCR仪参数以备后续实验
（2）按下表配制RNase Mix，涡旋振荡+短离心；
（3）用移液枪吸去每个小孔中的2X SSC Buffer；
（4）向每个小孔中加入75ul RNase Mix；用手指轻拍芯片盒以保证试剂充分覆盖捕获区域；
（5）用心的封口膜封住芯片盒，将其放在PCR仪适器上，37℃孵育30min；
（6）按下表准备透化混合液（Permeabilization Mix），用移液枪吹打混匀，注意不要涡旋振荡；
（7）待RNA降解完成后，从适配器上取下芯片盒，放置在干净平整的工作台面上；
（8）揭开封口膜，吸去每个小孔中的RNase Mix；
（9）向每个小孔中加入75ul Permeabilization Mix，用手指轻拍芯片盒，确保Mix充分覆盖芯片上的捕获区域；
（10）用新的封口膜封住芯片盒，将其放在PCR适配器上，37℃孵育40min；
（11）透化完成后，取下芯片盒，放置在干净平整的工作台面上，揭开封口膜，用移液枪吸去每个小孔中的Permeabilization Mix。透化过程中组织破碎是正常的，不影响透化效果；
（12）向每个小孔中加入175ul 2X SSC Buffer；
（13）吸去每个小孔中2X SSC Buffer；
（14）重复（12）（13）一次；
（15）最后向每个小孔中加入175ul 2X SSC Buffer进入探针延伸反应。
3.2 探针延伸
（1）按下表设置PCR仪，以备后续反应；
（2）按下表准备探针延伸反应混合液（Probe Extension Mix）；
（3）吸去每个小孔中的2X SSC Buffer；
（4）向每个小孔中加入75ul Probe Extension Mix，用手指轻拍芯片盒以确保捕获区域被充分覆盖；
（5）用封口膜封住芯片盒，将芯片盒放在PCR适配器上，盖上PCR仪的盖子；45℃反应15min；
（6）可进行后续反应或将芯片在芯片盒中4℃保存至多72h。
3.3 探针洗脱
（1）按下表配制0.08M KOH Mix，涡旋振荡+短离心；
（2）从适配器上取下芯片盒，放在干净整洁的工作台面上，揭开封口膜，吸去每个小孔中的Probe Extension Mix；
（3）每个小孔中加入100ul 2X SSC Buffer；
（4）吸去每个小孔中的2X SSC Buffer；
（5）向每个小孔中加入40ul 0.08M KOH Mix。轻轻用手指拍打芯片盒以使Mix 充分覆盖每个捕获区域；
（6）室温下孵育10min；
（7）转移含有连接产物的溶液到八联排PCR管中。尽量吸干每个小孔中的液体，液体中含有少量组织随便是允许的；
（8）向八联排PCR管中加入5ul 1M pH7.0 Tris-HCl溶液，涡旋振荡，短离心，置于冰上；
（9）直接进行后续反应或-20℃下储存至多72h。
4. 建库
4.1 qPCR确定循环数
（1）开始前准备好如下试剂耗材及仪器，试剂根据后续实验需要，调整到相应的温度；
（2）按下表在冰上准备qPCR Mix，涡旋振荡+短离心；
（3）向qPCR板中的每管加入9ul qPCR Mix, 可留有一管用于阴性对照；
（4）向含有qPCR Mix的每管加入1ul变性后的样品；移液枪吹打混匀，短离心；向阴性对照加入1ul nuclease-free water；
（5）按下表参数设置qPCR system，开始qPCR反应；
（6）记录每个反应的Cq值，Cq值大致位于荧光反应峰值的25%，即指数阶段的起始位置；
4.2 Sample Index PCR
（1）选择合适的sample index；
（2）向~45ul样品中加入50ul Amp Mix；
（3）向每个孔中加入20ul Dual Index TT Set A，记录每个样品孔的ID。吹打混匀5次，短离心；
（4）按如下参数设置PCR仪，进行PCR反应；循环数根据Cq值四舍五入；
（5）进入下步反应或者4℃保存至多72h。
4.3 Sample Index PCR后清洗
（1）涡旋振荡重悬SPRIselect试剂。向100ul样品加入85ul SPRIselect试剂（0.85X），用移液枪吹打混匀15次；
（2）室温下孵育5min；
（3）将PCR管放在magnet·High上直至溶液澄清；
（4）弃上清；
（5）加入200ul 80%乙醇至磁珠，静置30s；
（6）弃乙醇溶液；
（7）重复步骤（5）（6）一次；
（8）短离心，将PCR管放在magnet·Low上；
（9）吸去多余的酒精，风干2min。不要风干过长以免影响洗脱效率；
（10）将PCR管从magnet·Low上取下，加入25.5ul Buffer EB。移液枪吹打混匀15次；
（11）室温下放置2min；
（12）将PCR管放在magnet·Low上直至溶液澄清；
（13）转移25ul样品至新的八联排PCR管中；
（14）立即进行下步实验。如需保存，-20℃至多保存一周。
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