『珍藏版』Cell发布“相分离”研究指南

编译丨QY、赤贞

责编丨迦溆

图片引自：https://www.nyas.org

细胞是生物体结构和功能的基本单位，细胞内的各种组分如何在正确的时间以及空间上聚集以执行其相应的功能，是细胞在一系列基本的生命活动中需要解决的问题。为此，细胞进化出了一系列的细胞器，包括有膜包裹的（比如线粒体，细胞核，溶酶体等）和无膜包裹的细胞器（核仁等）。有膜包裹的细胞器将特定蛋白、核酸等物质包裹起来，以在特定的空间内执行其功能，如果这些蛋白或者核酸脱离特定的位置，将导致严重的后果（比如，细胞色素C释放到细胞质，将导致细胞凋亡，核酸释放到细胞质，将导致innate immune signaling pathway 的激活）。另一类无膜包裹的细胞器是如何形成，以及其物理化学本质，是困扰了大家多年的问题。

Hyman和Brangwynne 2009年在Science发表了题为：Germline P granules are liquid droplets that localize by controlled dissolution/condensation 的文章【1】，提出了细胞内通过“相分离”，可以提供一种特定的方式让细胞内的特定分子聚集起来，从而在“混乱的”细胞内部形成一定“秩序”，为困扰了大家多年的问题，提供了全新的思路。近几年的研究表明，液-液相分离（LLPS：liquid-liquid phase separation）可能是细胞形成无膜细胞器的物理化学基础,比如细胞内的p granule, nucleolar, stress granule等（图1）。

图1：细胞的的相分离结构。（引自参考文献【2】）

LLPS也被报道在一些疾病（如：癌症，以及神经退行性疾病等）的发生发展过程中起着非常重要的作用。相分离领域已经成为生命科学领域研究的热点，相关的文章近年来呈现井喷似的增长（见文末的延伸阅读：Bioart 系列解读）。（另外，Brangwynne在iBiology上面有三期的讲座，对这个领域的历史，以及其实验室相关的此方面的开创性工作做了非常具体的介绍，题目为：Liquid Phase Separation in Living Cells。链接：https://www.ibiology.org/biophysics/liquid-phase-separation-in-living-cells/  ）

Cliff Brangwynne (Princeton & HHMI)在iBiology上的介绍相分离研究

然而，像许多新兴的研究领域一样，该领域的研究对于实验的设计，以及实验方法还没有统一的标准和相关的指南，对于该领域的研究造成了一定的困扰，亟需建立一个从理论体系到具体实验设计的统一的标准。近日Simon Alberti, Amy Gladfelter, 和 Tanja Mittag联合在Cell 杂志发表了题为：Considerations and Challenges in Studying Liquid-Liquid Phase Separation and Biomolecular Condensates的文章，较为系统地阐述了LLPS相关的理论基础，提出了LLPS的体内体外的实验设计方法的具体指南。

相分离具体的作用可以参考另一篇由Hyman以及Michael Rosen执笔的发表在Nature reviews molecular cell biocology上的题为 Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry的文章，这篇文章更加系统的介绍了相分离的原理，以及其目前所报道的生物学功能【2】。另外，Simon Alberti等人在2018年，发表了另一篇题为A User’s Guide for Phase Separation Assays with Purified Proteins，非常细致地阐述了体外相分离实验的纯化蛋白的考虑以及一些相关的tips【3】。建议读者在具体的实验中可以参考此文章。这篇Cell文章更倾向于整体实验设计指南，为相关领域的研究提出一些标准化的实验步骤，也提出了一些这个领域还需要进一步阐述的机制，以及相分离的研究的根本目的，即要研究其生物学的具体功能。

相分离的基本概念，相分离的形式，以及如何预测一个蛋白是否会形成相分离现象

LLPS的发生，高度依赖溶液中生物大分子（比如：蛋白，DNA以及RNA等）的浓度、物理化学性质，以及溶液所处的环境，比如：温度、pH、盐离子浓度、盐离子类型以及溶液中存在其它的生物大分子。作者使用如下的Phase Diagram来描述这些与相分离相关的条件与该溶液是否发生相分离的关系（图2）。

图2：Schematic Phase Diagram

简单来讲：当溶液中所处的大分子浓度低于一个特定的值c时，这一体系无论在什么样的温度，pH等条件下都不能发生相分离。当高于这一浓度后，在合适的pH以及温度等条件下，就能形成相分离现象，形成相分离后，该生物大分子便有两种存在形式，一种是在溶液中的低浓度状态，一种是形成的“液滴”中较高浓度的形式存在。随着相关条件的变化，两种形式可以相互转化。也就是说，相分离是一种高度动态的过程。

另外，LLPS不仅能形成液滴状的结构，还能继续转变为胶状物的形式。凝胶状态的相分离经常不可逆转，这也为阿尔兹海默症等体内形成的amyloid-like fibers的形成，提供了全新的思路，为相关药物的设计提供了全新的理念。已有研究表明一些蛋白的突变会加快这种LLPS向凝胶状态转化的过程。

液-液相分离的发生是蛋白质和核酸在某种特定的情况下的一个普遍特性，然而多数相分离根本不可能发生在一个正常的细胞中。正如仅有一小部分蛋白质能够在生理状态下发生淀粉样改变那样，仅有一小部分蛋白质的序列具有在活细胞内形成相分离的能力。截至目前为止，我们对控制相分离的基因学及生物学特性仍所知甚少。因此，在断定相分离的发生时，我们应该尤其谨慎。

近几年涌现了许多对在生理状态下能够发生相分离的分子的普遍特征的研究。其中之一即是支架及客户蛋白的理论。支架分子被认为是相分离的驱动分子，而在相分离形成以后参与到液滴当中的则被称为是客户蛋白。支架蛋白与客户蛋白的相分离需要一个互作网络的形成，该网络常由蛋白质-蛋白质互作及蛋白质-RNA互作构成。

两种蛋白质类型参与促进此类互作网络的形成：一类以多个折叠的结构域为特点，如Nck蛋白中的SH3结构域，该结构域能够与短的线性模块如SLiMs相结合；另一类蛋白则以内部无序区（IDR）为特点。两类蛋白有多处相似，其中最重要的一点是：蛋白间都通过多个结构域或模块相互作用。因此，通过从基因上初步推断蛋白的化合价可以判断该蛋白形成相分离的能力及饱和浓度。对RNA而言，特定的RNA可驱动相分离的发生，而一些含有IDR的蛋白包含多个RNA结合结构域、其目的RNA也包含多个蛋白结合序列。因此，蛋白和RNA能够通过多种方式形成多价互作，这些互作决定着特定蛋白及核酸形成相分离的能力。

多价的蛋白质互作网络如何发生相分离这一问题，可以从高分辨率的结构数据中得到结果。然而，IDR是如何驱动相分离的则相对不那么容易理解。

IDR是相分离蛋白中一种常见的结构域，常常不含有芳香族及脂肪族氨基酸，且不能够形成一个相对能量较低的、单一的折叠结构。相反，这些蛋白的构象能量往往与其一级序列所含有的能量相同。一级序列往往决定了这些蛋白的相变能力、相变的驱动因素、相变的临界浓度及黏弹性。能够影响相分离的序列特征包括IDR的长度、数量、模式、及IDR与IDR间序列的特征。典型的决定因素包括疏水性氨基酸的组成、模式等。尽管IDR中疏水性氨基酸的含量相对较少，他们代表了相分离中的粘附成分、并根据温度变化调控相分离的浓度。带电氨基酸也能够影响相分离的形成，成对的、带相反电荷的蛋白能够以复合凝聚的形式形成沉淀。

IDR的另一个共同特征是由低复杂度序列区（LCR）构成，如单一氨基酸的重复序列。一个典型的LCR是朊病毒样LCR，富含极性氨基酸如丝氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺，不含有带电氨基酸。另一个典型的LCR是RNA结合蛋白中常见的RGG结构域，富含精氨酸，且能够调控LCR/RNA间的相互作用。LCR间相互作用的基础是电荷-电荷、共轭-共轭、阳离子-共轭互作。

因此，目前常应用预测算法推测蛋白质中的IDR以分析其发生相分离的能力（图3）。

图3：蛋白序列分析以及相分离预测工具

以FUS为例，IUPred算法鉴定前250个氨基酸、aa365-420、aa450-C端为潜在IDR，PLAAC算法鉴定到FUS N端含有QGSY-及G-重复序列，D2P2算法则区别了FUS的可折叠结构域与无序结构域。Anthony A. Hyman教授的团队则对这一预测算法的结果进行了实验验证。

体外重构相分离

相分离可以在体外通过纯化的蛋白以及核酸等在特定的条件下发生，体外重构的相分离实验对于该领域具有重要的作用（2012年，美国西南医学中心Michael Rosen和Steven McKnight独立发现在试管中这些分子通过微弱的作用力形成液滴，即首次证实了相分离能够通过简单的生化实验在体外重复【4, 5】。清华大学李丕龙教授便是Michael Rosen 这篇文章的一作）。

体外的相分离现象可以非常简单的使用普通的光学显微镜观察，发生相分离的特点是溶液会从澄清变得浑浊，镜检时会看到在溶液中会存在一些如水中的油滴状态的液滴。作者建议使用PEG或者lipids包被载玻片，以更好的观察和记录相分离现象。另外，可以将蛋白或者RNA使用荧光标记，或者将不同的组分通过不同的荧光分开标记，以方便使用荧光显微镜或者激光共聚焦显微镜拍摄出更好的图片，同时可以做FRAP等实验，以及持续拍摄获得LLPS动态变化过程。但是在具体应用此方法的时候要注意，一些RNA与RNA结合蛋白之间可能会被拍摄中的激光照射所交联，在拍摄的时候需要注意此类问题。

除此以外，可以使用检测溶液浑浊度的方法检测相分离，也可以使用离心沉淀的方法检测相分离现象。实验相关的具体的细节，推荐大家阅读香港科技大学张明杰教授题为Cell Phase transition in postsynaptic densities underlies formation of synaptic complexes and synaptic plasticity 的Cell文章中图4中的实验【6】。（另：Bioart专门邀请了张明杰教授过去的博士，现为复旦大学生物医学研究院PI 温文玉教授对张明杰教授的工作进行了系统解读，见延伸阅读）

另外，体外相分离的体外实验存在一定的局限性。体外相分离实验最大的优势是在于其各个组分以及各个组分的浓度，以及各种外在条件（比如：温度，pH等条件）可以被严格控制，更加方便我们去研究相分离现象。因此，需要注意的是，相关的蛋白以及RNA、DNA等各个组分的纯度是至关重要的。在此，作者提出了用于体外相分离实验的蛋白以及核酸样品的表达纯化，保存以及样品处理的标准。

蛋白纯化的考虑

用于体外相分离实验的蛋白可以在E.coli，酵母或昆虫细胞中表达纯化，或者通过体外转录/翻译系统得到。在能够发生相分离的蛋白中普遍存在无序区域（IDR：Intrici Disordered Region）在纯化的过程中非常容易被降解，因此在纯化此类蛋白时需要特别加以注意。含有IDR的蛋白质通常需要在纯化体系中加入蛋白酶抑制剂，需要快速纯化以防止蛋白的降解和蛋白聚集。另外，纯化此类蛋白可以让目的蛋白大量表达进细菌包涵体里面，这种方式可以防止被宿主体内的蛋白酶降解。但是，需要注意的是，在进行相分离实验之前，必须将蛋白复性到生理条件的缓冲液中。另外，表达蛋白的时候带上一些助溶的标签，比如MBP等，可以帮助得到较好的蛋白，但是在进行相分离实验的之前，需要将这些标签切掉，以免这些标签带来一些影响。

另外需要注意的是，蛋白质的翻译后修饰（PTM）对于相分离是非常重要的，在细菌表达纯化出来的蛋白一般翻译后修饰非常少，在真核细胞纯化的蛋白一般具有较好的翻译后修饰，建议真核表达的蛋白在做实验之前，最好先使用质谱等方式鉴定其翻译后修饰，以保证实验的可重复性以及利于更深入地了解该蛋白发生相分离的具体的分子机制。

在纯化的过程中，一般要避免目的蛋白发生相分离现象，但是如果发生相分离后，可以被一定的条件重新溶解，也可以通过利用这种反复发生相分离，溶解的方法来纯化该蛋白。纯化出来的蛋白需要用SDS-PAGE以及质谱等方式鉴定是否确实是目的蛋白以及鉴定其纯度。我们建议将蛋白保存在不发生相分离的Buffer中，保存Buffer通常在中性的pH, 使用高浓度或者非常低浓度的盐离子来防止发生相分离现象。同时需要加入还原剂。常用的Buffer体系如下（pH 缓冲体系：50mM  HEPES pH7.5, 盐离子：300 mM NaCl或者500 mM KCl, 或者不加盐离子，还原剂：1mM TCEP 或者5mM DTT ）。我们建议将蛋白分装后使用液氮速冻以后保存在低温的条件下，不要冻融蛋白，冻融会导致蛋白的聚集以及部分变性，影响其性质。在做相分离实验的时候，需要注意，对于每一个蛋白而言，都需要优化相应的PH，盐离子浓度以及温度等条件，尽量使其接近生理条件。详细的一些tips, 建议读者阅读另外一篇文章（Alberti et al., 2018）A User’s Guide for Phase Separation Assays with Purified Proteins

RNA来源

许多相分离需要使用RNA。 RNA可以使用体外转录或者直接化学合成。体外转录是较长的RNA非常好的来源，短链RNA可以直接从一些公司购买。 可以将RNA使用荧光标记，从而更方便的检测RNA与蛋白相分离的现象。

Macromolecular Crowders

另外，相分离对物理化学条件的变化非常敏感。温度，蛋白，核酸或盐浓度的微小差异也会导致不同的结果。因此，体外相分离实验应精确控制缓冲液的体系和蛋白浓度。

在相分离的实验中，经常使用到一些Macromolecular crowders，比如：PEG，Dextran或Ficoll。很多情况下，添加到实验中的crowder的量可能超过存在于细胞内的环境。目前，crowder是如何促进相分离发生的具体的机制仍不明确，因此，应当慎重使用crowder。如果使用crowder，我们建议使用多种crowder做实验，以排除由于Crower带来的假阳性的结果（私底下听到过有老师提到，可能80%左右的蛋白在有Crower存在的时候都可以发生相分离）。

小分子对于相分离的影响

在体外相分离实验体系中，可以测定LLPS是否改变酶的活性，从而研究相分离的生物学意义。在一些体外实验中，通常需要将高浓度的小分子化学物质（例如激酶抑制剂，甲基转移酶抑制剂等）添加到相分离体系中。此时应该考虑到，这些高剂量的小分子化学物质，除了本身对酶活的影响外，还可能对相分离产生直接作用，从而影响了酶活。

在体外，IDR通常足以介导相分离的发生。在高浓度下相分离的IDR的例子：Ddx4，LAF-1，FUS，hnRNPA1和Whi3的IDR。这些结果提示了这些IDR能够自主地通过homotypic interactions驱动相分离的发生。越来越多的证据显示，与同一多肽或其他蛋白其他区域的heterotypic interactions也可以驱动相分离的发生。另外，简单的单组分或双组分系统建立的理论如何扩展到细胞中的更复杂的混合物中，是亟待解决的问题。

相分离的物理特性

相分离液滴的物理状态变化极大。从液滴样直至多孔固体或胶体，其特性取决于相分离中的分子构成、时间、液滴的稳定程度、淬灭深度等。RNA的参与也可以影响相分离液滴的物理状态，但由于RNA既提供了多价结合位点、又贡献了静电，尚不清楚RNA究竟使其更流体化还是更固态化。由于不可逆的固态常被认为是一种病理状态，因此调控相分离的物理状态的因素仍有待进一步探究。体外重现相分离时，有多种方法可对液滴的物理性质进行具体描述。最直接的方法即测量表征表面张力的反毛细管速度，辅以被动微流变学，可推测液滴的表面张力。液滴表面与盖玻片间的接触角亦可表征液滴表面张力及表面的化学性质。

被动微观流变学通过在液滴内部置以珠子、测量该珠子的均方位移的方法表征液滴的物理性质。该方法受到多种因素的影响如液滴的组成、珠子的材料及大小、珠子表面的钝化程度、显微镜设备的漂移等。当相分离液滴极其粘稠乃至类似于胶体时，则可使用原子力显微镜或光镊来测量液滴内部的硬度。此外，还可使用荧光标记的右旋糖苷来检测相分离液滴中聚合物网格的孔径大小，以描述液滴的物理状态。

荧光漂白恢复实验（FRAP）常用于测量液滴的流动性，且其恢复时间因蛋白/RNA的不同而表现出很大的差异，尤其当对比蛋白质与RNA形成的相分离时，由于RNA的结构相对较刚性，其相分离液滴的FRAP时间往往更长。尽管FRAP是一个非常常见的实验，其应用的限制性却常常被忽略了。如FRAP的恢复时间不仅仅取决于液滴的稀释度，还取决于被光漂白的液滴大小、内部流动性、光漂白区域的大小等。如果条件允许，半荧光漂白恢复实验可以提供更多的关于液滴内部流动性的信息。此外，FRAP还可以用于评估液滴内部的同质性，但不能作为确定某一结构的形成机制是相分离的依据。

为更准确的估计相分离液滴内部某一分子的扩散能力，荧光相关光谱可作为检测手段之一。此外，偏振荧光显微镜可检测相分离液滴内部纤维性或固态样结构的各向异性成分。

检测细胞内的相分离现象

目前相分离领域的一个难点就是如何去鉴别细胞内的一些特殊的结构是否真的是相分离形成。在体外特定条件下，一些蛋白和RNA在足够的浓度或者合适的Buffer的情况下会发生相分离现象，通常通过在细胞内过表达这些蛋白，观察到形成较大的，球状的结构，以此来推测细胞内低浓度的该蛋白仍然会形成相分离，只是在普通的光学显微镜下无法检测到而已。然而，相分离需要足够浓度才能发生，因此，在使用过表达蛋白检测相分离的时候一定要考虑到外源过表达带来的影响。同时应该致力于寻找除过度表达之外的其他方式去证明细胞内确实发生了相分离现象。

目前被大家所接受的认为是相分离结构的的标准：形成球状结构，能够融合，同时使用FRAP技术，证明其能够发生荧光漂白恢复（图4）。但是FRAP实验并不是证明LLPS发生的金标准，仍然存在很多问题。

图4：检测相分离的方法

体内相分离液滴的物理特性

体外重现相分离现象时，对液滴物理特性的研究手段不胜枚举：如可利用延时显微镜测量液滴的反毛细管速度、通过FRAP测量液滴的流动性。然而如何探究体内相分离液滴的物理性质仍是一个难题。目前已有的手段如基因编码的纳米粒（GEMS）、荧光共振能量转移技术（FRET）、定量相显微镜（QPM）、折射率层析成像技术及更先进的布里渊显微镜等都可对体内相分离液滴的物理特性进行初步描绘。此外，体内相分离液滴的生物学功能也是研究的重点之一，如何改变液滴的性质以观察其功能，是未来的研究重点。

应用高分子化学来指导相分离研究的可行性及局限性

液液相分离研究的目标之一，是建立能够解释和预测大分子相分离现象的理论体系，并通过一级序列预测相分离的饱和浓度、刺激因素、液滴状态。高分子化学中的弗洛里赫金斯理论描述的是由焓介导的均聚合物从贫溶剂中析出的化学基础，其扩展理论考虑到了这一过程中的静电力作用。无规相近似方法则仅仅考虑了带电氨基酸的序列特征对杂聚体的形成的影响。此外，通过近似模拟也可以对相分离现象的机制进行进一步发掘：对单分子蛋白的模拟已能够较准确的说明其序列和功能间的关系，然而对成百上千个分子构成的相分离现象的建模及分析仍是目前的难点之一。对多组分相分离系统的粗粒化模拟初步解释了多层无膜细胞器如核仁形成的物理机制：蛋白-蛋白间、蛋白-RNA间的相互作用由序列决定；而不同细胞组分之间的相互作用呈互斥或亲和的状态，则可最终导致非随机的多层结构的形成。

算法模拟及理论体系可作为相分离现象实验数据的有力补充。反之，体内相分离现象的实验描述可作为算法模拟的数据库、并从中产生能够描述多分子复杂相分离现象的新的理论。

相分离到底意味着什么？研究相分离生物学功能

相分离研究的重点还是在于对其生物学功能的阐述。作者对目前报道的生物学功能进行了归纳总结（图5）：

图5：相分离功能总结

1. LLPS可以感知环境的变化，并对环境的变化做出快速响应。这种响应比通过细胞内的转录以及翻译过程更加快速。目前的一些研究已经证明，LLPS可以感知温度以及pH, 另外，还可以用于感知细胞内外源的DNA（cGAS相分离）

2. LLPS可以用来调节相关蛋白在细胞内的浓度。LLPS可以将高浓度的蛋白以液滴的形式储存起来，在细胞需要的时候将该蛋白释放到细胞环境中。

3. LLPS可以形成局部的高浓度蛋白，从而激活一些生化反应，激活相关信号转导途径以及促进细胞骨架的形成。

4. LLPS可以将一些蛋白与其底物隔离，从而抑制细胞内的一些生化反应过程。

5. LLPS可以介导一些蛋白定位到已经存在的一些无膜包裹的细胞器中。

6. LLPS的特殊结构可能对于细胞的形态起着重要作用。

7. LLPS可以介导形成一些孔状结构，比如核孔。

近年来，相分离领域已经成为生命科学领域研究的大热点，更多的相关的文章还在持续不断的发表，该领域对于揭示一些细胞的基础生物学问题以及对一些疾病的发生发展都将提供全新的思路。就在解读这篇文章的过程中，注意到Michael Rosen组在生物学预印本bioRxiv上online了一篇题为Organization and Regulation of Chromatin by Liquid-Liquid Phase Separation文章，说明了相分离在染色体的结构上起着重要的作用。

另外，去年12月份在深圳举行的的华人生物学家双年会上(The 12th biennial meeting of Chinese Biological Investigators Society )，诺奖得主Yoshinori Ohsumi 介绍了其实验室最新的研究进展， ATG13与ATG17结合能够发生phase separation的现象，揭示了autophagy中几个关键的conjugation system形成的物理学基础，作者发现突变了关键位点的 ATG13 与 ATG17 不再能形成相分离结构。从体外纯化的蛋白以及在细胞内都验证了这一理论。另外，去年清华大学俞立教授与李丕龙教授今年在 Cell research 上发表 了 Polyubiquitin chain-induced p62 phase separation drives autophagic cargo segregation的文章，报道了autophagy的adaptor protein P62能够发生相分离现象， 而且此现象能够介导 autophagy 对于底物的选择性。这些研究都将进一步拓展我们对于autophagy等领域的认识；

原文链接：

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867418316490

延伸阅读：

参考文献

1.    C. P. Brangwynne et al., Germline P granules are liquid droplets that localize by controlled dissolution/condensation. Science 324, 1729-1732 (2009).

2.    S. F. Banani, H. O. Lee, A. A. Hyman, M. K. Rosen, Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry. Nat Rev Mol Cell Biol 18, 285-298 (2017).

3.    S. Alberti et al., A User's Guide for Phase Separation Assays with Purified Proteins. J Mol Biol 430, 4806-4820 (2018).

4.    M. Kato et al., Cell-free formation of RNA granules: low complexity sequence domains form dynamic fibers within hydrogels. Cell 149, 753-767 (2012).

5.    P. Li et al., Phase transitions in the assembly of multivalent signalling proteins. Nature 483, 336-340 (2012).

6.    M. Zeng et al., Phase Transition in Postsynaptic Densities Underlies Formation of Synaptic Complexes and Synaptic Plasticity. Cell 166, 1163-1175.e1112 (2016).

制稿人：子阳

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