东华大学史向阳教授课题组在两性离子修饰的树状大分子纳米平台用于肿瘤免疫治疗上取得新进展

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免疫治疗因其在消除肿瘤和预防复发方面的强大作用，且与放疗、化疗等传统治疗方法相比而具备的更小的副作用、更长的疗效，已成为最受欢迎的肿瘤治疗策略之一。在机体发生抗肿瘤免疫反应的过程中，树突状细胞（DCs）作为一种抗原呈递细胞起着关键作用，它负责捕捉和处理肿瘤新生抗原，然后将处理后的抗原呈递给T细胞，进一步产生下游的T细胞免疫反应，杀死肿瘤细胞。一般来说，肿瘤患者体内有大量的新生抗原，但由于不能获得足够的、持久的抗肿瘤免疫反应，很难实现对肿瘤的彻底治愈。这主要是由于DC的免疫逃逸效应，限制了其有效的抗原呈递能力。研究发现，YTHDF1蛋白（RNA m⁶A甲基化的重要阅读蛋白）参与了DC相关的抗肿瘤免疫过程，其下调可以有效增强DC的肿瘤抗原交叉呈递能力，以便随后杀伤性T细胞浸润到肿瘤区域，提高抗肿瘤免疫效力。因此，DC中的YTHDF1蛋白被认为是一个潜在的肿瘤免疫治疗靶标。

呈现在T细胞或肿瘤细胞表面的免疫检查点分子也被认为是肿瘤免疫逃逸、限制内在的抗肿瘤免疫反应的关键。免疫检查点阻断（ICB）疗法被认为是提高治疗效果的一种有前途的策略。目前的免疫检查点分子主要包括与程序性死亡-1（PD-1）/程序性死亡配体1（PD-L1）、吲哚胺2,3-二氧酶和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白-4相关的抗体和小分子药物。目前，PD-1或PD-L1抗体常用于ICB，以促进T细胞的杀伤效果。然而，单一使用PD-1或PD-L1抗体似乎并不能对许多癌症类型发挥出有希望的免疫治疗效果，因而有必要将其他治疗模式或元素与PD-1或PD-L1抗体相结合，以达到增强的肿瘤治疗效果。

基于非病毒载体的基因治疗被认为是一种有效的肿瘤治疗模式。在众多非病毒载体中，聚酰胺-胺（PAMAM）树状大分子由于其独特的结构特点如三维立体结构、单分散性、易于表面修饰等，被认为是一种有前途的纳米平台。前期，东华大学史向阳教授团队利用功能化树状大分子包裹的纳米金颗粒（Au DENPs）作为载体，可递送PD-1 siRNA至T细胞，用于调节免疫检查点抵抗T细胞衰竭（Gao et al., Adv. Healthcare Mater. 2021, 10, 2100833）；也可递送PD-L1 siRNA至肿瘤细胞，沉默肿瘤细胞表面的PD-L1表达，进而实现肿瘤模型的免疫检查点阻断治疗（Xue et al., Sci. China Mater. 2021, 64, 2045-2055）。鉴于此，团队尝试采用Au DENPs作为载体负载siRNA对DCs进行基因改造，从而增强其抗原提呈能力，实现增强的肿瘤免疫治疗。在本工作中，团队构建了一种两性离子和甘露糖（Man）修饰的Au DENPs用于沉默DCs的YTHDF1基因并联合抗体介导的ICB共同促进肿瘤免疫治疗。首先，团队将Man和1,3-丙磺酸（1,3-PS）部分修饰到第5代（G5）PAMAM树状大分子表面，进一步在其内部包裹纳米金颗粒得到{(Au⁰)₂₅-G5.NH₂-Man-PS₂₀} （MDNP）用于递送YTHDF1 siRNA（siYTH）至DCs内，以增强其熟化程度，从而提高肿瘤抗原的交叉提呈能力（图1）。

图1.MDNP合成示意图及其免疫治疗机制。

团队首先在第五代树状大分子表面部分修饰Man使其具有良好的DC靶向性，随后部分修饰1,3-PS使其表面分布两性离子形成水化层而具备抗蛋白吸附性能，最后在其内部包裹纳米金颗粒以维持树状大分子的三维立体结构，进而增强载体的基因压缩能力。研究表明，合成得到的MDNP内部包裹的金核尺寸为1.8 nm，且尺寸分布均匀，具有良好的胶体稳定性和细胞相容性，能够高效压缩YTHDF1 siRNA，通过其抗蛋白吸附性能实现血清增强的基因递送。随后，通过体外实验研究了MDNP/siYTH复合物传递给DCs后的YTHDF1基因沉默效果，并同时评估了DCs表面CD80和CD86表达情况（图2A）。RT-qPCR和Western blot结果表明，与PBS、游离的siYTH或MDNP/siNC（阴性对照siRNA）复合物组相比，MDNP/siYTH复合物组的YTHDF1基因和蛋白表达都显著下调（图2B-D）。表明，MDNP载体可将siRNA传递给DCs，从而有效地抑制YTHDF1基因表达。流式细胞分析进一步证实MDNP介导的YTHDF1基因沉默可增强DCs的成熟度以激活下游免疫反应。如图2E所示，与其他组相比，经MDNP/siYTH复合物组处理的DCs表面的CD80和CD86的表达有明显上调。这表明，MDNP/siYTH复合物可以增强DCs的成熟度，可促进进一步的抗原交叉呈递。

图2. (A) MDNP/siYTH复合物被DCs吞噬后的机制作用示意图。(B）基于RT-qPCR检测的相对基因表达情况。（C-D）DCs经过不同处理后的YTHDF1蛋白表达水平。(E）流式细胞仪检测不同实验组处理的DC中CD80和CD86的表达结果。

随后团队进一步探究了MDNP/siYTH复合物对B16肿瘤模型体内肿瘤免疫治疗效果（图3A）。如图3B所示，所有小组的小鼠体重都略有增加，这表明所有治疗组都无明显系统毒性。此外，结果显示MDNP/siYTH复合物和PD-L1抗体（aPD-L1）的联合治疗表现出最好的肿瘤抑制效果（图3C-J）。通过免疫荧光染色和流式细胞仪分析体内免疫细胞表达情况表明，MDNP/siYTH复合物组表现出良好的CD4+、CD8+ T细胞的肿瘤浸润效果，证明MDNP/siYTH 联合 aPD-L1的联合治疗能够明显地激活小鼠体内的免疫反应，增强体内的抗肿瘤免疫效应。

图3. (A) 小鼠体内治疗过程示意图。(B-H）不同时间段内小鼠体重及肿瘤体积变化。治疗第12天肿瘤切片的（I）TUNEL和（J）H&E染色结果。

以上研究以“Genetic Engineering of Dendritic Cells Using Partially Zwitterionic Dendrimer-Entrapped Gold Nanoparticles Boosts Efficient Tumor  Immunotherapy”为题，发表在美国化学会期刊Biomacromolecules (DOI: 10.1021/acs.biomac.1c01571)上。东华大学化学化工与生物工程学院博士研究生欧阳智俊为第一作者，东华大学史向阳教授和沈明武研究员为共同通讯作者。该工作得到了国家自然科学基金委、上海市科委等项目的资助。

论文链接：

https://doi.org/10.1021/acs.biomac.1c01571

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