【Biol Psychiatry】浙大陈忠教授团队揭示胆碱能环路参与癫痫发作的神经机制

癫痫是一种慢性中枢神经系统疾病，不分年龄。
全世界有大约5000万癫痫患者，使之成为全球范围内最常见的神经系统疾病之一。
近80%的癫痫患者生活在低收入和中等收入国家。
如果得到适当诊断和治疗，估计高达70%的癫痫患者不会出现癫痫发作。
与普通人群相比，癫痫患者的过早死亡风险要高出3倍。
在低收入国家，有四分之三的癫痫患者不能得到所需的治疗。
在世界许多地方，癫痫患者及其家庭遭到羞辱和歧视。
----世界卫生组织 2019年6月20日

癫痫（epilepsy），俗称的“羊角风”或“羊癫风”，是一种慢性中枢神经系统疾病。癫痫发作是由于大脑神经元突发性异常放电，导致正常脑功能中断，临床表征为反复不自主发作，身体某一部位或整个身体短暂非自主性抽搐，有时伴有意识丧失和尿便失禁。据中国最新流行病学资料显示，中国约有900万左右的癫痫患者，同时每年新增加癫痫患者约40万，已成为神经科仅次于头痛的第二大常见病。

癫痫最常见的形式之一是颞叶癫痫（temporal lobe epilepsy，TLE），这种癫痫发作起源于边缘区域，尤其在海马中最为常见[1]，颞叶是功能非常复杂的脑叶，有非常高级的记忆认知功能。TLE的长期后果可能是记忆功能、学习能力和情绪控制失调。此外，工作、出行和体育活动也受影响。

TLE发作机制复杂，目前，对于TLE神经机制的研究多集中在兴奋性谷氨酸能神经元和抑制性GABA能神经元之间的平衡上[2]。有研究报道，中枢神经系统胆碱能活动参加癫痫的发作[3-4]，也有文献报道，基底前脑胆碱能神经元的免疫激活也能促进海马癫痫发作[5]，这些数据表明，大脑不同区域的胆碱能神经元在癫痫发作中有着不同的作用机制。因此，解析TLE中胆碱能神经系统的精准环路机制及靶向神经元的类型对治疗癫痫至关重要。

2019年11月26日，《Biological Psychiatry》杂志在线刊登了浙江大学陈忠教授课题组题为“Direct septum-hippocampal cholinergic circuit attenuates seizure through driving somatostatin inhibition”的最新研究工作[6]，他们首次发现MS胆碱能神经元发挥抗癫痫作用的精准神经环路机制，为临床精准治疗癫痫发作提供了新思路。

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内侧隔核是胆碱能神经元富集的核团，且其是癫痫灶点海马的胆碱能输入的主要来源，因此研究人员将目光聚焦于内侧隔核。在该研究中，陈忠教授课题组的研究人员首先利用浙大附属二院癫痫中心临床颞叶癫痫患者的核磁共振成像和弥散张量成像（可分别用于指证脑内核团结构及环路纤维的变化），发现颞叶癫痫患者基底前脑的内侧隔核区及其与海马之间的神经纤维联系均存在明显的萎缩，由此猜测内侧隔核与颞叶癫痫密切相关。
    进一步，研究人员在癫痫动物模型中探究内侧隔核在颞叶癫痫中的潜在作用。文章中所用的颞叶癫痫动物模型是海马电点燃癫痫模型和海人藻酸颞叶癫痫模型，即通过在海马给予电刺激或致痫药物海人藻酸导致脑内神经元过度兴奋，进而产生癫痫发作行为并伴随癫痫样脑电。研究人员首先分别通过光遗传学选择性激活内侧隔核的胆碱能、谷氨酸能和GABA能神经元，发现激活内侧隔核的胆碱能神经元能够抑制颞叶癫痫发作，进而将课题聚焦内侧隔核胆碱能神经元。

结果

1、海马癫痫发作时MS胆碱能神经元活动受到抑制

首先，作者引入小鼠海马电点燃癫痫发作模型[7]研究内侧隔核（medial septum，MS）胆碱能神经元在颞叶癫痫（temporal lobe epilepsy，TLE）中的神经机制。他们在ChAT-Cre小鼠MS中注射AAV-EF1a-DIO-Gcamp6s，借助钙信号光纤记录监测海马癫痫发作期间小鼠MS胆碱能神经元集群的活动变化（图1A, B），结果显示，海马癫痫发作过程中MS胆碱能神经元的钙信号变化明显低于基线，并且这种下降程度在全身性癫痫发作过程中比局灶性癫痫发作时表现更显著（图1C-E）。

为更精准的定义MS胆碱能神经元在海马癫痫发作期间的活动变化，科研人员对麻醉状态下ChAT-ChR2-YFP小鼠MS胆碱能神经元进行在体单细胞记录（图1F），给予蓝光刺激时，响应的神经元具有较低的自发放频率（发放频率0.04-0.5Hz），并在夹尾实验时发放频率增加（图1H），这与胆碱能神经元的典型特征一致[8]。此外，66.7%胆碱能神经元在癫痫发作开始后几乎立刻停止放电，发作结束后恢复，这与光纤记录结果一致，然而，对蓝光刺激无响应的非胆碱能神经元在海马癫痫发作时表现出多样活动变化（图1I-K）。这些结果提示了在海马癫痫发作过程中，MS胆碱能神经元的活动受到抑制。

图1 海马癫痫发作时MS胆碱能神经元活动受到抑制

2、MS胆碱能神经元参与TLE发作过程

为进一步明确MS胆碱能神经元在海马癫痫发作过程中的作用机制，研究人员将AAV-EF1a-DIO-hChR2-eYFP定位注射在ChAT-Cre小鼠（ChAT：：ChR2小鼠）MS中。免疫组化结果显示，ChR2-eYFP特异性表达于MS胆碱能神经元上（图2A, B）。随后，借助全细胞膜片钳记录发现，蓝光刺激可以诱发表达ChR2的胆碱能神经元的动作电位并诱导其表达c-fos（图2C, D），提示了蓝光刺激能实时激活MS胆碱能神经元。

在小鼠海马电点燃癫痫发作模型中，蓝光刺激激活MS胆碱能神经元能明显延缓ChAT：：ChR2小鼠癫痫发作等级，并缩短后放电时程（ADD）（图2E）。同时，抗癫痫作用贯穿在整个时期，这是因为，蓝光激活MS胆碱能神经元增加了局灶性癫痫和全身性癫痫发作停留的电刺激次数，从而增加了达到全身性癫痫发作和完全点燃状态所需要的电刺激次数（图2F-G）。

随后，研究人员通过向海马脑区注射海人酸（Kainic acid, KA）诱导慢性自发颞叶癫痫模型作进一步验证[9-10]。他们在ChAT-Cre小鼠MS中注射AAV-EF1a-DIO-hM3Dq-mCherry（ChAT：：hM3Dq小鼠），借助化学遗传学技术发现，在慢性癫痫发作期间，激活MS胆碱能神经元可减轻EEG强度，降低自发发作次数和总时长（图2J-M）。这些结果提示了在海马电点燃癫痫发作模型和慢性自发颞叶癫痫模型中，特异性激活MS胆碱能神经元均可以显著抑制癫痫的发作。

图2 特异性激活MS胆碱能神经元抑制海马癫痫发作

接下来，作者继续研究MS胆碱能神经元的内源性活动对调节海马癫痫发作的作用机制。在ChAT-Cre小鼠MS中注射AAV-EF1a-DIO-Arch-mCherry（ChAT：：Arch小鼠），使抑制性光敏感蛋白Arch特异性表达在MS胆碱能神经元上，且用全细胞膜片钳记录发现，黄光刺激能有效抑制其动作电位发放（图3A-C）。在小鼠海马电点燃癫痫发作模型中，借助光遗传学技术在电刺激之前抑制MS胆碱能神经元能显著促进癫痫发作等级，延长ADD，减少达到全身性癫痫发作和完全点燃状态所需要的电刺激次数，也减少0-2级局灶性癫痫发作停留的电刺激次数，并增加了海马癫痫EEG强度（图3D-G）。

同时，研究人员采用了一种更直接的方法，借助AAV病毒载体，将tacasp3（AAV-flex-tacasp3-TEVp）注射ChAT-Cre小鼠MS中（ChAT：：Casp3），特异性杀死MS胆碱能神经元（图3H, I）。在小鼠海马电点燃癫痫发作模型中，杀死MS胆碱能神经元促进癫痫发作等级，延长ADD，增加了癫痫EEG强度（图3J-M），这与上述光抑制结果一致。这些结果提示了海马癫痫发作过程中MS胆碱能神经元的活动受到抑制。

图3 特异性抑制MS胆碱能神经元促进海马癫痫发作

作者借助多种技术手段双向调控MS胆碱能神经元对TLE发作产生双向的作用，提示了MS胆碱能神经元在TLE发作过程中的重要作用。

3、内侧隔核到海马的直接胆碱能投射通路参与抗癫痫作用

有研究发现，内侧隔核是海马胆碱能输入的主要来源[11]，同时，研究人员借助ChAT：：ChR2小鼠中病毒表达情况，也进一步验证小鼠海马脑区分布着广泛的MS胆碱能纤维末端（图4A, B）。基于此，为探究内侧隔核到海马的直接胆碱能投射通路是否参与MS胆碱能神经元的抗癫痫作用，他们给予ChAT：：ChR2小鼠背侧海马CA1区蓝光刺激发现，癫痫发作受到抑制（图4C-F）。

研究报道，MS胆碱能神经元也可以通过先向MS内部GABA能和谷氨酸能神经元投射，再投射到海马[12-13]。因此，为探究间接胆碱能投射通路对MS胆碱能神经元抗癫痫作用的应用，研究人员将乙酰胆碱受体阻断剂注射ChAT：：ChR2小鼠MS中，然后对MS胆碱能神经元进行光刺激（图4G），结果发现，乙酰胆碱受体阻断剂并不能逆转激活MS胆碱能神经元诱发的抗癫痫作用（图4H-J）。

上述结果提示了内侧隔核到海马的直接胆碱能投射通路参与MS胆碱能神经元的抗癫痫作用，而间接投射通路不参与该抗癫痫作用。

图4 内侧隔核到海马的直接胆碱能投射通路参与抗癫痫作用

4、海马GABA能亚型SST神经元是MS胆碱能神经环路发挥的抗癫痫作用的下游效应神经元

基于上述结果，研究人员对MS胆碱能神经元是如何调控海马神经元的做进一步研究。他们借助光遗传学技术激活ChAT：：ChR2小鼠MS胆碱能神经元到海马的轴突末梢，同时记录海马神经元的放电活动（图5A），并按照神经元波形和放电自相关分析区来区分海马中的GABA能神经元和锥体神经元[14]，发现记录到的海马GABA能神经元有一半的神经元放电现象，而锥体神经元表现出多样的响应变化，大部分响应的锥体神经元发放受到抑制且存在1s左右的潜伏期（图5B, C）。这些结果提示了激活MS胆碱能神经元到海马的轴突末端可以激活海马中部分GABA能神经元。

为进一步探究GABA能神经元的功能变化，研究人员将AAV-Vgat-Cre和AAV-EF1a-DIO-mCherry混合注射ChAT-ChR2-YFP小鼠海马中。离体脑片全细胞膜片钳记录结果显示激活胆碱能末端可以增加GABA能神经元的放电频率（图5D, E）。同时，抑制海马锥体神经元，然而这一现象在加入钠通道阻滞剂TTX和钾通道阻滞剂4-AP后可被完全阻断（图5F）。这些结果提示了激活MS胆碱能神经元可以直接激活一部分海马GABA能神经元，GABA能神经元的激活对海马锥体神经元产生抑制作用，即间接抑制锥体神经元的放电。

随后，作者借助改造后的可逆向单跨突触的狂犬病毒示踪技术绘制MS胆碱能神经元与海马神经元之间的联系[15]，结果显示，MS胆碱能神经元与海马GABA能和谷氨酸能神经元存在直接的突触联系，且与GABA能神经元的突触联系要多于和谷氨酸能的。

接下来，研究人员将AAV-Vgat-Cre和AAV-EF1a-DIO-hM4Di-mCherry混合注射ChAT-ChR2-YFP小鼠海马中（图5K），发现化学遗传学技术抑制GABA能神经元可逆转由光刺激海马CA1区胆碱能神经元末端引起的抗癫痫作用（图5L-N）。这些数据提示了海马GABA能神经元参与介导MS胆碱能神经元抗癫痫环路，且是其下游机制。

图5 海马GABA能神经元介导MS胆碱能环路的抗癫痫作用

基于GABA能神经元亚型的多样性[16-17]，研究人员探究了PV（小清白蛋白）和SST（生长素抑制素）阳性GABA能神经元（GABA能神经元两种主要亚型）参与MS胆碱能神经元抗癫痫作用的不同机制。借助PV-Cre和SST-Cre小鼠以及病毒示踪技术发现，这两种GABA能神经元亚型均可以接受来自MS胆碱能神经元的单突触输入（图6A-D）。

最后，研究人员将AAV-PV-Cre或AAV-SST-Cre分别与AAV-EF1a-DIO-hM4Di-mCherry混合注射ChAT-ChR2-YFP小鼠海马中（图6E-G）。在小鼠海马电点燃癫痫发作模型中，给予CNO药物抑制SST阳性神经元可抑制由光刺激海马CA1区胆碱能神经元末端引起的抗癫痫作用，表现为癫痫发作等级的延缓，和ADD的缩短（图6G-K）。这些结果提示了海马SST阳性神经元可能是MS-海马胆碱能抗癫痫环路的下游机制，同时，只激活海马SST阳性神经元足以抑制癫痫发作。

图6 SST神经元是MS胆碱能神经环路发挥的抗癫痫作用的下游效应神经元

结论

本篇文章借助神经示踪、在体光纤记录、全细胞膜片钳记录、光遗传学、化学遗传学、免疫组化、行为学等技术手段研究发现，MS胆碱能神经元在癫痫小鼠模型中发挥抗癫痫作用的精准神经环路机制，即通过直接投射到海马，激活下游SST阳性神经元发挥作用的。该研究为临床精准治疗癫痫发作提供了新思路。

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陈忠教授课题组常年致力于慢性脑病的发病机制及药物靶点发现研究，其中癫痫发病机制的研究是课题组重要的研究方向。课题组近年来在Neuron（F1000 Recommend）、Annals of Neurology、EBioMedicine（F1000 Recommend）、Neurotherapeutics、Neurobiology of Disease等国际著名期刊发表多项原创性工作，受到国内外学者的关注。该研究在前期工作的基础上，首次从临床和基础两个层面阐明了胆碱能环路在颞叶癫痫中的作用，补充了基于传统“兴奋性谷氨酸能传递与抑制性GABA能传递”失衡的传统发病机制学说，同时解析了海马不同细胞亚型GABA能神经元的作用异质性，有望为临床精准治疗颞叶癫痫提供新的药物靶点和治疗策略。

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