最近科研界什么比较流行？外泌体（Exosomes）是当之无愧的热点话题。不论在肿瘤领域、神经科学领域还是代谢领域，都有大量的外泌体相关文章发表，以探究外泌体的功能和机制。再梳理一下外泌体的基本知识。外泌体是一类大小为30-150nm、呈茶托状的由脂质双层膜包裹的细胞外囊泡，广泛存在于细胞培养上清及各种体液中，包括血液、淋巴液、唾液、尿液、卵泡液、精液、心包液、乳汁等。外泌体内含有多种蛋白质（如TSG101、HSP70等）、核酸（DNA、RNA）和脂质（胆固醇、鞘磷脂等），这些内容物因释放外泌体的细胞不同而有比较大的差异。外泌体首先需要从样本中分离出来，目前比较公认的分离方法是超速离心法，再通过透射电镜（TEM）、纳米粒径跟踪分析（NTA）、Western Blot等进行鉴定。获得外泌体后，对外泌体进行标记，观察外泌体被摄取情况，再进一步探索外泌体的功能，如组织修复、肿瘤转移、代谢重建等。下面我们仔细聊一聊外泌体标记的方法。目前已发表的外泌体文章中，外泌体大多使用亲脂性染料进行标记，体内和体外都有较多应用。亲脂性染料主要分为两大类，第一类是PKH67（绿色荧光）/PKH26（红色荧光），由于它们可以与外泌体的脂质双层膜稳定结合，所以染色效果较好，应用较广泛。
Acta Neuropathol Commun. 2018 Feb 15;6(1):10.
图2 PKH26标记的外泌体与MDA‐MB‐231细胞共培养
Cancer Sci. 2019 Oct;110(10):3173-3182.第二类是Di系列的亲脂性染料，包括DiI（橙色荧光）、DiO（绿色荧光）、DiD（红色荧光）、DiR（深红色荧光）。其中DiR的红外荧光可穿透细胞和组织，在活体成像中用来示踪。
图3 DiI标记的外泌体通过静脉注射观察在体内器官的分布情况
J Cereb Blood Flow Metab. 2018 May;38(5):767-779.
BMC Cancer. 2018 Jan 6;18(1):47.
图5 DiR标记的外泌体静脉注射小鼠结肠癌肿瘤模型J Nanobiotechnology. 2020 Jan 9;18(1):10.
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将外泌体的特定蛋白CD63和绿色荧光蛋白GFP的表达元件构建成质粒再包装到慢病毒中，随后用此慢病毒感染细胞，使细胞分泌的外泌体带有绿色荧光。
图6 用GFP标记的外泌体分别与SH-SY5Y、BV2和DRG细胞共培养Artif Cells Nanomed Biotechnol. 2019 Dec;47(1):2918-2929.
图7 注射有CD63-GFP的外泌体后观察第1天(D1)和第5天(D2)的荧光Artif Cells Nanomed Biotechnol. 2019 Dec;47(1):2918-2929.03
用金纳米颗粒（Gold nanoparticles，GNPs）标记：
将金纳米颗粒标记的外泌体通过鼻内给药不仅能进行无创跟踪，而且能促进外泌体在脑部的积累和延长在病变区域的存在时间，增强体内神经成像的效果。因此，这种外泌体标记技术可以作为多种脑疾病的强大诊断工具，并可能增强基于外泌体的神经恢复治疗。
ACS Nano. 2017 Nov 28;11(11):10883-10893.
ACS Nano. 2017 Nov 28;11(11):10883-10893.这是一种使用两亲性探针对NIR荧光标记的外泌体进行内源性检测的方法，无需对外泌体进行免疫标记或合成或色谱处理。由于NIR波长的荧光探针能穿透体内组织，从而提供了从细胞直接转换到体内使用的好处。
图10 未标记外泌体和NIR标记外泌体的原子力显微镜图片Chem Commun (Camb). 2018 Jun 26;54(52):7219-7222.05
用Gaussia luciferase（gluc）和截断的lactadherin标记：
将gLuc-lactadherin构成融合表达的质粒，再将此质粒转染细胞，使细胞分泌的外泌体带有强的萤光素酶活性。将标记的外泌体进行静脉注射入小鼠体内，看外泌体在组织的分布情况。
图11 将表达了gluc-lactadherin的外泌体静脉注射入Balb/c小鼠J Biotechnol. 2013 May 20;165(2):77-84.
外泌体标记对探究外泌体的功能是必不可少的一个步骤，首先需要观察到外泌体被受体细胞吸收或到达目的组织、器官，再检测受体细胞、组织或器官中相应指标的变化，看外泌体是否具有一定的功能。确定外泌体具有功能后，再通过高通量测序或基因芯片进行差异表达分子的挖掘，进一步深入研究机制。如果您对我们的实验数据有任何疑问，欢迎在微信公众号下方留言，我们将逐一解答。