10x单细胞免疫组库VDJ数据分析就看它

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免疫组库研究的方法有很多，包括多重PCR、5’RACE等，但是传统的方法并不能获得每个细胞的BCR和TCR的具体状态，无法做到将TCR/BCR双链完美匹配。2015年，10x Genomics发布了基于微流控和油滴包裹技术的Chromium单细胞系统平台，可实现高通量的单细胞转录组和单细胞V(D)J测序。不但可以将TCR/BCR双链完美匹配，而且可以细化到单细胞水平，同时获得表达谱信息。目前该技术也是研究单细胞免疫组库应用最广泛的技术，那么10x 单细胞免疫数据该如何分析？分析结果又有哪些呢？今天小编带大家来聊聊单细胞免疫组库测序数据分析那些事。

首先，利用VDJtools可以快速分析免疫组库数据。对于10x vdj的数据也可以使用VDJtools进行分析。具体分析步骤和结果见下文：

1、软件下载

对于linux而言，可以直接通过https://github.com/mikessh/vdjtools/releases/tag/1.2.1，进行下载。

zip安装包中包含了所需的jar文件，无需编译，下载即用。

VDJtools会调用R去进行绘图。所以需要先安装所需的R包。VDJtools提供了命令可以一键安装相关的R包：

java -jar vdjtools.jar Rinstall

2、输入文件格式

示例数据下载地址：https://github.com/mikessh/vdjtools-examples

数据格式：

对于VDJtools而言，所需的clonotype数据包括这些：

Variable (V) segment name.  V区基因名

Diversity (D) segment name for some of the receptor chains (TRB, TRD and IGH). Set to . if not aplicable or D segment was not identified. D区基因名，如果是‘.’则是未获得

Joining (J) segment name.  J区基因名

Complementarity determining region 3 nucleotide sequence (CDR3nt).  CDR3的核苷酸序列

Translated CDR3 sequence (CDR3aa).  CDR3的氨基酸序列

Somatic hypermutations (SHMs) in the variable segment (antibody only, planned). V区的体细胞突变

其他都是可选列。

输入数据需要用制表符分隔。

Metadata数据格式如下：

需要表头，前两列是文件名和对应的样本名，后面列可以是各种样本信息。

3、格式转换

对于10x免疫组库数据而言，在利用cellranger获得了结果后，可以从filtered_contig_annotations.csv表中提取出所需要的信息。

将10x的结果数据转换成需要的格式

10x数据：

将样本处理成需要的格式：

4、分析

VDJtools主要分为6个分析模块，分别是基础信息统计、多样性评估、样本间的overlap、过滤和重采样、Clonotype操作和注释。

基础信息统计：

CalcBasicStats计算统计样本的基础信息，如：read counts，平均克隆型大小，非功能性克隆型的数量等

VDJTOOLS="java -Xmx20G -jar vdjtools.jar"

VDJTOOLS CalcBasicStats -m data/metadata.txt out/0

结果：0.basicstats.txt，里面记录了样本的一些统计信息

CalcSegmentUsage 计算样本中V/J段中的每个片段的频率。

VDJTOOLS CalcSegmentUsage -m data/metadata.txt -p -f age -n out/2

结果：2.segments.wt.J.txt

2. segments.wt.V.txt

V/J的频率统计表

-p 打开画图 -f 指定用于着色的数据列 

CalcSpectratype 计算spectratype，即CDR3核苷酸长度的读计数直方图

VDJTOOLS CalcSpectratype -m data/metadata.txt out/1

PlotFancySpectratype 绘制一个频谱类型，它还显示给定样本中前N个克隆类型的CDR3长度。

VDJTOOLS PlotFancySpectratype data/A4-i125.txt.gz out/3

PlotFancyVJUsage 绘制圈式的V-J图，显示各种V-J连接的频率。

VDJTOOLS PlotFancyVJUsage data/A4-i125.txt.gz out/5

PlotSpectratypeV 绘制V段的在CDR3序列长度上的分布

VDJTOOLS PlotSpectratypeV data/A4-i125.txt.gz out/4

多样性评估

PlotQuantileStats 画一个三层的甜甜圈图，形象化展示曲目克隆

VDJTOOLS PlotQuantileStats data/A4-i125.txt.gz out/6 

RarefactionPlot 绘制特定样本列表的稀疏曲线，即样本多样性与样本大小的相关性。

VDJTOOLS RarefactionPlot -m data/metadata.txt -f age -n -l sample.id out/8

CalcDiversityStats 计算多样性，如：Chao1,Shannon-Wiener index, Inverse Simpson index,d50 index

VDJTOOLS CalcDiversityStats -m data/metadata.txt out/7

样本间overlap

OverlapPair 对一对样本进行克隆型共享的综合分析

VDJTOOLS OverlapPair -p data/A4-i189.txt.gz data/A4-i190.txt.gz out/9

CalcPairwiseDistances 对一个样本列表执行overlap，并计算相似度。至少要提供3个样品

VDJTOOLS CalcPairwiseDistances -m data/metadata.small.txt out/10

ClusterSamples 根据批次交叉的结果进行样本聚类 

TrackClonotypes 用于克隆类型跟踪目的。用户可指定将追踪哪些克隆类型

VDJTOOLS TrackClonotypes -m data/metadata.small.txt -f age -x 0 -p out/11

 Pre-processing

Correct 执行基于频率的错误克隆型校正

Decontaminate 在一组样本中过滤可能的交叉样本污染

DownSample 执行下采样，如：从样本中随机读取一个子集

FilterNonFunctional 过滤非功能性clonotypes

SelectTop 从样本中选择数量最丰富的克隆型

FilterByFrequency 根据指定的频率阈值过滤克隆类型

ApplySampleAsFilter 从样本中筛选特定样本中存在的克隆类型

FilterBySegment 根据V/D/J段过滤克隆类型

Clonotype表格操作

PoolSamples 将几个样品的克隆型聚在一起

JoinSamples 在克隆型数据中加入一组样本

注释

克隆型表功能注释(抗原特异性、氨基酸性质等)。

CalcCdrAAProfile 使用氨基酸物理特性构建CDR3区域

Annotate 为克隆型计算一组基本的氨基酸的物理性质

以上就是VDJtools工具的使用方法和结果展示，10x 单细胞免疫组库数据也可以高效分析出高品质的图谱，如果老师对单细胞免疫组库研究感兴趣的话，请快快与我们联系，百迈客竭诚以待。

百迈客是国内首批引进10xGenomics单细胞测序平台，使用Chromium系统采用先进的微流控、油滴包裹和barcode标记等技术实现一次性分离、高效标记捕获；同时具有10x 单细胞转录组、单细胞核转录组、空间转录组、单细胞免疫组库、全长转录组测序，实现10x平台全面优质服务；已经具有大量单细胞分离捕获，极低量RNA反转录扩增建库成功经验；提供单细胞分离捕获、反转录建库、测序、标准分析和高级分析全套单细胞测序服务；强大的生信团队不仅提供基本分析，还提供细胞分化轨迹分析等多种高级分析；资深单细胞技术人员为您提供专业的课题方案设计，为您量身订造专属个性化分析。百迈客医学科研服务事业部，是您值得信任和托付的团队，我们将竭诚为您服务，期待与各位老师在今后的日子携手合作，相信百迈客出品，必是精品。

参考资料：

https://vdjtools-doc.readthedocs.io/en/master/intro.html

 文：ZLY
排版：市场部

                                                  
往期回顾：