单细胞研究胃肿瘤微环境-轻轻松松发高分文章
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目前单细胞测序技术广泛应用于肿瘤、免疫治疗、神经发育、药物耐药机制研究等领域，充分肯定单细胞在生物科学领域应用价值。特别是在肿瘤微环境方面的应用探索，该技术表现出明显的优势，可以全面解析肿瘤微环境的异质性，详细分析各个细胞间的联系机制。那么如何利用单细胞转录组测序技术研究相关课题呢？此次小编给大家带来了斯坦福大学医学院今年发表在Clinical Cancer Research（IF=8.911）期刊探究胃肿瘤微环境的细胞重编程文章，此文可以带给大家更多的研究思路，值得借鉴学习。一起来看看大牛如何利用单细胞测序技术发表高分文章，详情请看下文：
肿瘤微环境(TME)可以影响细胞状态和功能，不同TME对免疫治疗产生截然不同的影响。基于单细胞测序分辨率有利于识别肿瘤内异质性和肿瘤间异质性，进而更明确的表现出TME的不同细胞特点。
样本来源：胃癌(7)+胃肠上皮化生(1)；配对正常组织(8)+PMBCs(2) 制作高质量单细胞悬液：组织解离样本+PBMC 测序方式：10x Genomics 数据质控和统计 细胞：>200个基因，线粒体基因占比<20％或UMI数量处于异常范围 基因：>3个细胞
胃癌与肠上皮化生队列和单细胞转录组谱 本文作者从7例胃癌(GC）患者和1例肠道上皮化生(GIM)患者的手术切除或内镜活检中获得组织(包括配对正常组织，图A)。IHC结果显示GC肿瘤具有肠道，弥漫性或混合性特征(图B)。基于scRNA-seq，作者获得了来自GC或GIM的32,407个单细胞转录谱，配对正常组织中18,657和PBMCs中5,103个单细胞转录谱。
为了弄清楚基因表达的变化，作者对单独的各个数据集进行了数据质控（QC），主成分分析（PCA）和聚类。作者采用UMAP来降维的同时可视化Cluster。之后使用Bonferroni校正后的p<0.05作为阈值，将在Cluster中大于25％的细胞中表达且logFC大于0.25的基因判定为差异表达基因。作者将每个Cluster的差异基因与各种细胞类型中已知标记基因进行了比较后，对Cluster进行定义：上皮细胞(表达PGC，TFF1，MUC5AC，EPCAM，GIF，CHGA)，成纤维细胞(THY1，DCN，COL4A1，FAP)，内皮细胞(PECAM，ENG，VWF，SELE)，免疫细胞(PTPRC)，[CD4+T细胞(CD3D，CD4，IL7R)，细胞毒性T细胞(CD3D，CD8A，CD8B)，Treg细胞(FOXP3，IL2RA)，NK细胞(NKG7，GNLY)，B细胞(MS4A1)，浆细胞(免疫球蛋白基因)，肥大细胞(TPSAB1)和巨噬细胞(CD68，CD14，FCGR3A)。（图C和图D）
合并数据集并联合分析 为了能够识别所有患者以及样本之间的相似性和差异性，作者将GC，GIM与正常组织和PBMCs 的scRNA-Seq数据汇总到一个集合数据集中，并基于文库制备和测序深度对批次效应进行了消除。聚类分析后确定了40种不同的簇，这些簇对多种特异性细胞类型，包括上皮，基质(成纤维细胞，内皮细胞)，淋巴细胞，巨噬细胞和肥大细胞，这些簇在所有患病样本中均被发现(图E)。 分类肿瘤，正常和化生上皮细胞群 作者发现肿瘤，化生和正常上皮细胞之间的差异是来源于不同患者的肿瘤上皮细胞之间的差异以及单个肿瘤内的亚克隆异质性。从之前合并的数据集中对上皮细胞进行重新聚类分析后得出了三个亚类。第一个亚类是正常胃上皮细胞（有超过80%来自正常胃样品，下图中A,B,C三个小图）。第二个亚类由肿瘤特异性上皮细胞组成（GC 1型），这些细胞中约有98%来自肿瘤样本，GC 1型组中的每个簇在一名患者占主导地位–这表明GC肿瘤间存在异质性，同样提示每个肿瘤都具有独特的转录特性。第三类涉及源自GC上皮细胞以及正常组织，这些细胞可能具有与肿瘤上皮和化生上皮重叠的转录特征。 为了对胃癌与正常上皮细胞进行更准确的分类，本文作者选用scPred基于转录组数据对肿瘤和正常上皮细胞进行分类，结合对基因表达矩阵方差结构的分解来识别有限的信息特征，并针对这些特征采用机器学习的方法来对其对细胞分类造成的影响进行估算。结果表明scPred和Seurat的分析结果相一致（图D）。 肿瘤和正常上皮的CNV差异 使用scRNA-seq，可以通过对基因表达的相应增加还是减少进行分别分析来检测染色体水平的扩增或缺失。为了识别肿瘤与正常上皮的CNV差异，作者将每个患者的normal与GC 1型或GC 2型组进行了比较（图E）。在P6207患者的GC 1型，7p，7q，8q和9q中检测到CNV扩增，而在10p中出现CNV缺失。P6342患者的肿瘤出现20q的CNV扩增和4q的CNV缺失。对于具有化生和P6592的患者P6649，样品仅包含少量细胞，其拷贝数变化明显。这些CNA结果进一步证实了GC数据集中正常和肿瘤上皮细胞之间的区别。 肿瘤内异质性和肿瘤间异质性 作者对不同患者的GC 1型和GC 2型细胞的致癌通路做了分析，进而得到图E的激活水平的显著差异，进而证实了肿瘤肿瘤间转录异质性。但值得注意的是，这些激活程度并没有根据MSI和MSS分子亚型之间的差异进行聚类，个别患者的肿瘤包含GC 1型和GC 2型细胞的多个簇，表明肿瘤内异质性。通路分析将每个患者的肿瘤的这些簇分成三到五个亚群，进而可以确认亚克隆结构（图G）。基于这些结果，作者得以假设这些亚群可能会给肿瘤提供明显的生长优势。 TME重编程导致除M1和M2之外的巨噬细胞状态 与正常胃组织相比，肿瘤免疫微环境(TME)中巨噬细胞具有明显的基因表达变化。巨噬细胞分为M1或M2型，分别具有抗肿瘤和促肿瘤作用。然而，作者观察到的巨噬细胞对应的基因表达特征不符合M1或者M2型。同时，作者在所有患者中检测到了11个不同的簇，观察到了髓系谱系细胞的各种亚类（下图A-D）。九个单核巨噬细胞簇由CD14,FCGR3A,CD68的标记基因表达定义；两个树突状细胞(DC)簇由CLEC4C，ID2，IRF4和CD83的标记基因表达定义(下图C)。值得注意的是，与正常的胃部组织相比，巨噬细胞在肿瘤中明显富集（下图E）。作者检查了巨噬细胞簇中M1(CCL19，TNF,CCL5)和M2(MRC1，CCL18，CCL13，CD163)型标志基因的表达(图3F)。M1/M2型巨噬细胞的标志基因均不能分群。而且，这些基因在用一簇中共表达，这表明转录异质性是独立于M1/M2型巨噬细胞。下图G表明转录异质性与HSP家族基因，THBS1,趋化因子（CCL20,CCL18,CCL3),MMP9,补体家族和细胞周期调控基因的表达差异有关。PBMC中的单核细胞与肿瘤或者正常组织内的巨噬细胞呈现出分离状态，表明具有转录异质性（下图B,D）。作者对于组织中的巨噬细胞和PBMC中的单核细胞进行轨迹推断（图H）。单核细胞以单个轨迹状态存在，大多数组织巨噬细胞沿两个不同状态分化。这表明浸润肿瘤的巨噬细胞不同于单核细胞，但和正常组织内的巨噬细胞保留了一定程度上的基本相似性。DC可分为2种亚群，其中一个具有浆细胞样DC的标志基因，比如：IL3RA(CD123)和CLEC4C(CD303)-该亚类主要在PBMC中可以检测到（图C，图D）。另一种具有活化DC的标志基因，如CD83,CCR7,IL7R和ID2，以上结果提示即巨噬细胞存在于一组特定基因而非M1/M2型巨噬细胞调节功能状态。
本文作者主要是通过质控，标准化和归一化，降维，聚类，寻找差异基因，谱系分析(轨迹推断)等常规的单细胞测序方式对胃癌细胞进行分析，并通过后续诸如联合CellPhoneDB推断细胞间受体和配体的互作；联合拷贝数变异分析；对Cluster进一步分类(Sub-Cluster)等方式进行详细分析，进而鉴定出肿瘤内和肿瘤间同一种类型细胞的异质性。例如巨噬细胞内的转录异质性(不依赖于M1和M2型巨噬细胞)；细胞毒性T细胞内的转录异质性(具有肿瘤耗竭T细胞型亚组的转录学特点)。证明了TME基质细胞编码一种在正常组织中不存在的特殊ECM成分，揭示了新的基因调控网络和TME特异性细胞间通讯。
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文：WKS
排版：市场部