单细胞揭示白血病化疗药物靶向转录因子的活性

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导读

背景：骨髓中紧密的调节循环协调着B细胞的命运。该基因调控网路中的基因突变导致了儿童癌症的出现，如急性淋巴细胞白血病ALL。初始的基因冲击如常见的易位ETV6和RUNX1基因融合导致了细胞分化受阻。在这里，作者的目的是在B系分化轨道上确定转录因子的活性，作为描述白血病骨髓中异常细胞状态的参考，并确定那些维持癌症特异性细胞状态的转录因子，以便进行更精确的治疗干预。方法：作者使用单细胞转录组测序（scRNA-seq）和一些互补基因组图谱比较了正常B系分化和体内白血病细胞状态。基于统计工具的scRNA-seq，作者以一个工作流程为基准来解决健康骨髓淋巴细胞状态中的转录因子活性和基因表达分布变化。作者将这些与诊断时和化疗期间急性淋巴细胞白血病患者体内骨髓样品进行了比较，重点关注携带ETV6-RUNX1-融合的白血病患者。结果：结果表明骨髓scRNA-seq中淋巴细胞转录因子活性与ATAC-seq和ChIP-seq数据结果一致。利用这一综合参考调节因子B系分化，作者对ETV6-RUNX1阳性的所有病例的分析显示白血病细胞状态中多种ETS转录因子的活性升高，包括白血病全基因组关联研究ELK3敲除。伴随而来的基因表达变化与白血病免疫微环境中自然杀伤细胞的失活和缺失有关。此外，结果表明诊断时G1细胞周期状态丰富和诱导化疗过程中缺乏分化相关调控网络的改变是化疗耐药性的特征。为了靶向白血病调控过程从而克服治疗耐药性，作者使用scRNA-seq表明ETS转录因子的抑制降低了细胞生存能力并解决了导致这一结果的途径。结论：本文数据提供了描述正常B系分化和在白血病患者骨髓中获得的转录因子活性详细图谱，并为针对白血病免疫微环境和活性调节网络的新治疗策略提供了合理的基础。关键词：细胞分化、白血病、基因调节、单细胞基因组学

发表期刊： Genome Medicine

影响因子：10.675发表时间：2020.11.20原文链接：https://genomemedicine.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13073-020-00799-2

研究背景

淋巴细胞分化失败是急性淋巴母细胞白血病发生的基础，其发病率在儿童时期达到顶峰。了解正常B细胞分化是描述淋巴母细胞引起的癌症的基础。关键淋巴转录因子的变化是急性淋巴细胞白血病发生和恶化的遗传基础。单细胞基因组学有望解决白血病基因调控过程，甚至是很少细胞量、mRNA、染色体和DNA分型。本文作者阐明了正常B系分化造血干细胞（HSCs）的细胞状态和TF活动特征，并将其与诊断和标准化疗期间的E/R+ ALL病例进行比较。

材料方法

实验材料：ALL患者、E/R+ REH 细胞系

实验方法：scRNA-seq、ATAC-seq、ChIP-seq、RNA-seq

研究结果

1、骨髓B系分化状态单细胞转录组

为了更好地了解早期B细胞分化情况，作者处理了HCA提供的骨髓scRNA-seq数据，并使用UMAP将每个细胞投影到二维图中。本文得到了以CD34+星状细胞为中心的分支图，根据细胞周期标记基因评分，细胞周期母细胞状态导致了更多分化的细胞，这些细胞主要存在于G1细胞周期状态，而基质细胞或成熟T细胞（CD3D+）、NK细胞（GNLY+）和浆B细胞在BM外成熟，则单独聚集。

作者分离了B系分支进行进一步分析，得到了一个用于HSCs B系分化的11个clusters参考数据集（图1a）。前两个clusters符合HSC（G1或细胞周期状态S/G2/M）。DNA核苷酸外转移酶和MME的marker基因表达可以区分早期淋巴母细胞进入CD19表达周期和G1 pro-B细胞状态（图1b）。图1c所示为基于拟时间分析的聚类拟时排序。基于此分析细胞状态之间的进展与指定的分化阶段一致。这些细胞状态注释与使用基因集定义的流式排序B细胞群体分化状态评分高度一致（图1d）。基于RNA速度分析这一基因队列的RNA动力学可以进一步解释B系细胞状态图谱（图1e）。

在早期B细胞状态下，早期淋巴细胞中DNTT上调，mRNA表达进一步增加（图1f）。此外，在细胞周期进入小pre-B状态前有两个连续循环的细胞状态：Sphase marker基因PCNA上调即细胞从早期淋巴细胞进入第一循环状态其mRNA在S期细胞达到峰值；与随后在G2/M状态下mRNA水平达到峰值的TOP2A速度的增加一致。这些细胞周期状态下的标记基因的速度和mRNA水平连续增加表明了图中细胞的方向并最终从细胞周期进入pre-B I G1状态（图1g）。

图1骨髓scRNA-seq中B淋巴分化状态分离 2、TF活性的变化揭示了B细胞分化的调控动态

TFs严格控制着B系轨迹细胞状态的转变。图2a显示通过严格的R²cutoff值获得B系分化阶段调节因子的活性评分。图2b显示参与主要B系loop的TFs表达水平进行比较。本分析中，EBF1、FOXO1、LEF1和TCF4 以及ETS因子ERG和FLI1在pro-B细胞中活性最高，TCF3和PAX5在pro-B和pre-B细胞状态中具有同样高的活性。在pre-B细胞中，SPIB和IRF4的活性随后升高，同时一些抑制TFs的负调控因子，如BCL11A和已知的辅抑制因子复合物成分HDAC2和TBL1XR1与糖皮质激素受体相互作用促进终末分化。

在本分析中显著富集的TF motif证实了9/12的TF调控子与pro-B G1细胞状态相关（图2c）。在儿科BM数据集中，pro-B活性调节因子也具有高度相似的活性特征（图2d）。对于PAX5和EBF1超过75%的 预测靶标具有ChIP-seq峰关联（图2e）。ATAC-seq motif富集与基于ChIP-seq验证的靶基因位点上的TF结合高度一致，TF得分反映真实主动的调节互作。总之，作者对健康BM单细胞转录组的分析为早期B系分化在单细胞分辨率下的基因表达和TF活性变化提供全面的参考。

图2 B系分化转录因子活性

 3、E/R白血病细胞类似于pro-B细胞状态并在细胞周期活动中表现出异质性

淋巴母细胞白血病是细胞分化受阻的结果，通常携带初始遗传病变，直接影响关键的淋巴类TFs。为了描述ALL白血病细胞中携带最常见的TF融合，作者对6例小儿E/R+ pre-B-ALL病例进行了scRNA-seq，分别收集诊断为BM和2例在诱导化疗第15天的BM（图3a和表1）。根据DNTT的表达以及正常BM细胞类型的清晰分离，对每个供体的白血病细胞簇进行鉴定（图3b）。基于B系cluster特异基因集，诊断性白血病细胞类似于pro-B分化状态（图3c）。不同病例细胞周期状态分布不同，ALL3细胞循环比例最低而ALL9中最高（图3d）。2例（ALL10和ALL12）中诱导治疗BM图谱，第15天收集的细胞分离成不同的细胞状态（图3a和d），表明治疗能进一步改变白血病细胞状态。

作者使用ZP聚类研究发现，在HCA E/R+和pro-B细胞的G1和细胞周期状态中272个基因上调90个基因下调（图3e）。与沿着B系分化轨迹的其他细胞状态相比，大约三分一的上调基因在E/R+细胞中处于最高水平，而cluster1、2、5和6中的基因在白血病和正常干细胞/母细胞中表达（图3e）。与E/R+ G1细胞到pro-B G1细胞表达分布相比，TGFB1、LY6E、TERF2和HLA-E有助于上调低NK细胞的招募和激活（图3f）。

图3 E/R+细胞与正常pro-B细胞比较 4、E/R+BM免疫微环境中NK细胞低丰度低活性

细胞基因的表达的增加可能抑制NK细胞活性促使进一步分析BM免疫细胞。与HCA BM供体相比E/R+ BM中GNLY或NKG7阳性NK细胞数量显著减少（图4a）。为了进一步研究免疫细胞群，作者将HCA和E/R+ ALL供体的T细胞和NK细胞合并联合分析。通过聚类和标记基因分析可以区分几种不同NK细胞类型（图4b和c）。作者关注了表达GNLY或NKG7的clusters（clusters 0、2、3、7、10、11和16），与HCA供体相比来自ALL BM的NK细胞不成比例的分配到这些clusters中（图4d）。ALL NK细胞主要在匹配粒酶K表达不成熟的CD56^bright和过渡性NK细胞的cluster10和16（图4e）。然而，NK类型在不同供体中出现的频率不同（图4f）。总之，白血病细胞状态不同于正常的pro-B分化状态，这是由于高表达的干细胞/母细胞特异性基因和一些免疫调节基因。免疫调节基因的改变反映在E/R+ BM中NK细胞类型更加不成熟。

图4 E/R+ 骨髓中NK细胞数量和活性降低

 5、白血病调控过程揭示TF活性不忠及白血病风险基因进一步破译导致表观遗传重编程异常的TF活性可以从正常淋巴细胞状态中区分E/R+白血病细胞，作者重复TF调节因子活性分析包括来自BM患者的诊断性白血病细胞状态（图5a）。活性减弱的调节因子包括RUNX1、SPIB、TCF3和IRF4（图5a）。为进一步证实，作者大量bulk基因表达数据集上分析了与E/R+细胞中高活性的阳性TF调节子相匹配的TF表达（图5a）。基于bulk转录组作者验证B-ALL中的表达，E/R+亚型中检测到比例最高，血液恶性肿瘤样品t-SNE分析突显了淋巴恶性肿瘤（图5b）。进一步分析E/R+细胞中TF结合位点（图5c）。GRO-seq图谱证实了这些基因位点在E/R+细胞中的转录活性（图5c）。还揭示了ELK3 TSS上游一个未注释的转录起始位点（图5c）。注释的ELK3转录本从剪接点跨越reads最高的支持，而上游转录本与MiTranscriptome lncRNA结构匹配最好（图5c）。 6、化疗期间持续存在的白血病TF活性为克服耐药性提供了新的靶点作者分析了标准白血病诱导治疗对ALL10和ALL12获得的scRNA-seq图谱对TF表达的影响（图5d）。ALL12第15天的样品TF图谱表明白血病基因调控程序持续存在，缺乏pre-/immature-B TF上调（图5d）。作者以糖皮质激素耐药E/R+ REH细胞为细胞模型，在不同药物剂量下进行增殖和活性测定（图5e）。TK216抑制基因富集在剪接和DNA复制相关的功能中（图5f）。相比之下，XRP44X抑制基因与P53靶基因和MHC复合基因相匹配（图5f）。综上所述，靶向ETS因子的小分子抑制剂可以通过直接作用于白血病调节网络、细胞周期和免疫调节基因对耐药白血病细胞有效。

图5E/R+白血病细胞TF活性

总结

本研究首次全面描述了E/R+ ALL患者的细胞状态和TF活性，并将其与正常人类B系分化在单个细胞分辨率下进行了比较。进一步证明了使用单细胞基因组学监测早期治疗反应的可行性，以及发现新的治疗靶点的潜力。通过对单细胞和bulk基因组学数据的联合分析，确定了在白血病细胞中导致异常细胞表型的TF活性。这些结果可以为开发靶向白血病免疫细胞交叉和耐药治疗白血病细胞状态的新疗法提供合理的基础。

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文：TL

排版：市场部

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