Cell子刊|空间转录组在阿尔茨海默症中新发现………

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摘要：

阿尔茨海默症（Alzheimer disease，AD）是一种严重的神经系统疾病，伴随着心智和生理功能的逐渐丧失。短期记忆差和嗅觉障碍是AD早期的早期症状。新的证据表明嗅觉障碍可能早于认知能力下降的开始。通常情况下，嗅觉障碍被个体视为味觉丧失，随着疾病的进展而恶化；然而，嗅觉缺陷、神经退化和痴呆之间的关系仍不清楚。本文的研究希望通过空间转录组测序分析发现海马区和嗅球结构层中新的和已知的分子靶点，这些分子靶点可能导致AD小鼠早期海马区突触缺失和嗅觉功能障碍。研究人员发现与线粒体生理机能和细胞死亡有关的Bok基因是小鼠和人类AD大脑海马区的一个空间下调基因，为进一步深入了解AD病理学提供了丰富的空间差异表达基因资源。

研究方法：
基因工程小鼠模型被广泛用于表征AD的分子特征，包括AD相关的差异基因表达。三重转基因小鼠AD模型3xTg-AD（3xAD）表达三种人类基因变体：APP K670N/M671L、MAPT P301L和PS1 M146V。DNA损伤发生在AD疾病病理过程的早期，为了测试DNA修复的重要性，创建了一个DNA聚合酶β（Polb）缺陷的3xAD的版本。之前的研究发现人类AD患者大脑中这种蛋白及其聚合酶活性的缺失，3xTg AD/Polb+/-（3xPB）小鼠的行为和生化分析显示，与对照组小鼠相比，这些小鼠在记忆、学习、长时程增强（LTP）、嗅觉功能、线粒体内稳态等方面表现出更严重的缺陷，并且具有更高水平的DNA损伤和细胞死亡。海马区和嗅球在AD病理学中起着核心作用，因此，研究人员选用3xAD、3xPB和对照组小鼠的海马体和嗅球（OFB），通过强大的空间转录组测序和分析技术来挖掘存在显著空间差异表达的基因。空间转录组技术的主要特点是它将定量转录组学与高分辨率组织成像相结合；它结合了高分辨率组织成像和无偏空间定位的RNA测序技术，这使得基因表达谱能够锚定到感兴趣的器官或组织的物理图上。相比之下，先前的脑组织提取的RNA的序列数据由于缺乏空间信息而受到限制。本文的研究集中在三个的差异表达基因集群上。首先，分析了所有解除调控的基因。其次，找到显示出空间特异表达显著发生改变的基因。第三，明确3xAD和3xPB小鼠之间显著的差异表达基因。最后，通过挖掘了这些基因在人类AD脑组织中表达的已发表数据，以明确小鼠的结果是否适用于人类。最终，发现了一个存在显著差异表达的编码Bok的基因。这个基因在老鼠AD大脑中，是显著下调的。此外，通过免疫组织化学和公开的单核RNA序列数据证实了它在人类阿尔茨海默病大脑中也被解除了调控。 研究结论AD小鼠的长时程增强（LTP）和嗅觉测试验证疾病模型研究人员选用 3xAD (triple transgenic APP, PS1, and MAPT)和3xPB (a quadrupole transgenic Polb+/-, APP, PS1, and MAPT)的小鼠作为实验组，以WT (wild-type C57BL/6J) 和PB (transgenic Polb+/-)小鼠作为对照组，对不同基因型的小鼠进行LTP突触传递测试和嗅觉测试。LTP突触传递测试：与WT相比，两种AD系小鼠的海马LTP的兴奋性突触后电位均显著降低（图1A），3xPB组和3xAD组分别下降了32.6%和27.2%。与WT小鼠相比，PB小鼠也显示出18.7%的显著下降。这一发现的意义尚不清楚，但表明DNA修复对维持LTP是很重要的。嗅觉测试：由于嗅觉缺陷是AD神经退行性变的早期标志物，研究人员用掩埋食物试验来测试嗅觉功能。结果表明，3xAD和3xPB小鼠的表现不如WT和PB小鼠，而PB和WT小鼠在本试验中表现相似（图1B）。 
采用空间转录组技术鉴定与小鼠海马和OFB解剖层相对应的差异表达基因和分子簇研究人员对海马体和嗅球进行了冷冻切片和空间转录组测序，得到了48个组织切片的结果并进行分析。海马区检测到15062个位点和22701个独特基因，平均每个位点4516个基因（图2A）。同样的方法，嗅球检测了5059个位点和20471个独特基因，平均每个位点4812个基因（图2B）。采用HE图像和Allen脑图谱对表达簇进行解剖学注释。得到14个明确的基因表达簇，与大脑半球的解剖层相对应（图2C）。 然后，选取了3个与海马CA1-2、CA3和DG亚区相对应的簇，选取嗅球GCL、MCL、EPL和GL的4个簇通过不同组别间的差异表达分析和空间位置特异性的差异表达分析进行进一步的基因挖掘分析。海马区和嗅球的整体基因表达改变分析
        利用来自海马区和嗅球区的空间转录组数据，对每个脑区的多层/簇中检测存在显著差异表达的基因。共有124个基因在海马体和嗅球的一个或多个层中存在差异表达（图3A和3B）。这些基因参与的调控过程大约三分之一与新陈代谢有关，另外三分之一与突触传递和神经系统发育有关。只有三个基因在两个AD数据中受到差异性调控，但在PB基因列表中没有：Ubc和Gm10073在两种AD小鼠中均下调，而Glo1在这两种AD小鼠中均上调（图3B）。
 
海马区空间差异表达基因的鉴定从海马区数据分析得到的964个存在差异表达的基因中筛选出55个显著差异的基因。在所有海马层中都检测到了一些基因。 Pkm、Cox6c、Rps2和Tmem59l 基因在AD小鼠中下调 （图4A和4B），GABA、Gabra2、 Lpl和Wbp11基因存在上调，Bok和Rasl11a在CA3和丘脑区域的表达降低，如图4C所示。
在3xAD和3xPB小鼠的比较中发现了在翻译和应激反应信号中重要的基因 

DNA修复缺陷的3xPB小鼠疾病进展更快，由于3xAD和3xPB小鼠之间是高度自交的，这两种小鼠之间的差异表达基因相较于与各自的WT小鼠是比较少的。在海马体中，Paip1基因在3xPB小鼠中整体下调，但在3xAD小鼠中没有。该基因编码的蛋白质参与翻译起始。Sgk1基因在3xPB小鼠中特异性上调，Sgk1是一种主要的应激反应激酶基因，也是3xPB小鼠海马体和OFBs中同时被解除调控的少数基因之一（图3B），它参与多种应激相关信号传导。RPA2，GADD45A，CDKN1a（p21）和POLb蛋白在DNA损伤的反应中都很重要，这一发现与先前的报道一致，即3xPB小鼠积累了更多的DNA损伤。

嗅球空间差异表达基因的鉴定

嗅觉功能障碍是AD的重要早期标志物，AD小鼠患有各种进行性嗅觉缺陷；然而，目前还没有很好的AD嗅觉障碍生物标志物。因此，研究人员对不同基因型小鼠的嗅球进行了详细的空间基因表达分析。发现了73个空间差异表达的基因（图5A和5B）。除了Pla2g7基因外，大部分下调的基因与海马区相同。在WT和PB小鼠中，Pla2g7在嗅球的外层显示出显著的表达，而在AD小鼠中这种表达消失了（图5C）。Pou6f1在AD小鼠的嗅球中显著下调，结果表明，在AD小鼠中，Pou6f1在嗅球和海马区中的表达减少可能会显著改变突触功能，并导致嗅觉和LTP的丧失。Glo1、Stk25、Ctss和 Fam32a基因上调，Nav1在3xPB小鼠嗅球的EPL和GL中上调。Apold1在GL中下调，Fosb和Nr4a3在WT和PB小鼠的OFB的MCL和GCL中显著表达，而在AD系中则明显下调。

 
海马CA3区空间表达的BOK基因，在小鼠和人类AD大脑中表达缺失根据之前的报道，功能失调的线粒体与AD病理学有关。BOK是一种参与线粒体凋亡和线粒体动力学的线粒体蛋白。根据得到的空间转录组分析数据，3xAD和3xPB小鼠海马CA3区和丘脑的Bok也下调（图4、4C）。这表明BOK可能在AD病理学中起作用。为了验证在AD小鼠中存在空间限制性表达和差异表达的基因是否也存在人类的AD数据中，研究人员获得了人类的AD和健康内嗅皮层样本的人类单核RNA-seq数据。图6A显示了来自该数据集的人类AD-BOK表达的UMAP图。一部分AD少突胶质细胞和混合来源的细胞BOK基因似乎出现上调。根据Del Aguila等人发布的人类单核RNA序列数据集，顶叶组织的少突胶质细胞（上调）和神经元（下调）中也发现了BOK表达的改变（图6B）。为了进一步验证BOK在AD病理学中的作用，研究人员对死后AD患者和非痴呆对照的海马和丘脑切片进行了BOK免疫荧光标记。在这两个区域，BOK的细胞总荧光信号明显减少，这主要是由核BOK信号的丢失引起的（图6D-6G）。这些结果与AD小鼠模型中观察到的海马和丘脑BOK减少一致。

总而言之，空间转录组这种新兴的技术，将定量转录组学与高分辨率组织成像和无偏生物信息分析相结合，将表达数据锚定到器官或组织的物理图图谱上。作者等人通过这一技术绘制了3xAD、3xPB、PB和WT小鼠海马体和OFBs的基因空间表达图谱。鉴定了新基因和已知基因在AD小鼠脑中的差异表达，并证实了BOK在人类AD患者大脑中的空间受限差异表达。发现的一些Ubc、Pkm、Cox6c和Glo1等解除调控的差异表达基因可能会具有更深远的意义，因为这些基因都能影响细胞的代谢状态。

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文献下载：

https://international.biocloud.net/zh/article/detail/33083725

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文：GJY

排版：市场部

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