1.长期体外扩增鉴定克隆性TEC
首先，作者试图从人胸腺基质细胞中分离具有克隆潜能的细胞。将胸腺组织酶解成单细胞悬浮液，并置于致死辐照的饲养层上，衍生胸腺上皮细胞，所有胸腺，独立于供体年龄，包含克隆性TEC产生菌落，可在每周传代时广泛扩展(图1a)。采用了细胞分选策略来解剖和前瞻性地分离胸腺基质室，包括上皮细胞(皮质和髓质TEC)和间质(TIC)。为了确定胸腺克隆细胞的转录谱，使用EpCAM和CD205的表达水平来分离EpCAMhighCD205−髓质TEC (mTEC)和EpCAMlowCD205+皮质TEC (cTEC)(图1b)。出乎意料的是，大量的mTEC(>60%)和几乎所有的cTEC以及TIC也表达了间叶细胞标记物CD90 (THY1)(图1c)。作者对培养的1型mTEC、1型cTEC以及在没有任何分选策略的情况下培养的TEC进行了全基因组RNA测序。通过对培养TEC的RNA测序，检测到SIX1、ey1、HOXA3、PAX1和PAX9等基因的表达，证实克隆性TEC保持了独立于起源室的胸腺特性。皮质的(CSTV, KNICP3，CD274)和髓细胞(CDH1, EpCAM, CD24)基因被培养细胞保留(图1g)。
图1. 胸腺上皮细胞(TEC)和间质细胞(TIC)的前瞻性分离
2.单细胞RNA测序定义了体内髓细胞和皮层细胞群的共同特征
为了使用体外扩增的克隆源性细胞进行胸腺重建，首先在体外对新分离的mTEC和cTEC相关的细胞概况进行对比。因此，对新分离的1型和2型mTEC和cTEC的亚群进行了单细胞RNA测序(scRNA-seq)，将其置于其他小鼠和人类的scRNA-seq研究的更广泛背景中，当mTEC和cTEC亚群在一个UMAP中出现时（图2a）,能够在分类的上皮细胞中标注出主要的细胞亚群,根据共同特征了定义15个可区分的细胞群：cTEC分为三个主要亚群，而mTEC分为5个亚群，除此之外，作者还鉴定了皮质和髓质共有的4个TEC簇（“comTEC”;图2b），根据单细胞分类，剩下的三个簇(残余细胞)代表多形核、树突状细胞和胸腺细胞污染物（图2b）。这些主要细胞亚群通过分类视图特征图中显示的cTEC、mTEC或comTEC的特定基因标记进行验证(图2c)。comTEC簇包括以上皮-间充质转化(EMT)特征为特征的细胞(簇12)，增殖标记物(簇13)和聚角蛋白表达细胞(簇14)，而簇15表现出丰富的离子转运蛋白的独特特征，当作者将comTEC和特定mTEC和cTEC集群的转录特征与克隆基因TEC的体外转录谱进行比较时，很明显，后者表达的转录标记存在于comTEC(增殖、EMT和多角蛋白)中，但不存在于其他新鲜分离的mTEC或cTEC簇中（图2d）。
图2. 对新分离的TEC进行单细胞RNA测序，确定了在体外维持的mTEC和cTEC的共同细胞簇
3.TEC共表达上皮细胞和间质标记物，但与胸腺间质细胞不同
基于流式细胞仪观察到CD90 (THY1)与EpCAM显著共表达(图1c)并且通过在新分离的TEC comTEC簇中检测EMT特征，作者进一步研究了人类胸腺上皮细胞可能具有独特的上皮-间充质杂交表型的可能性。为此，作者对供者的产后胸腺进行了免疫组化分析，并清楚地检测到细胞角蛋白(CK)与间质标记物如CD90、波形蛋白(VIM)以及中胚层标记物TE7一致共表达(图3a)，从而在蛋白质水平上证实了在健康胸腺组织中表达的杂交表型。
在培养中，克隆基因TEC为CD49f+，处于活跃细胞周期(MKI67+)， CK5-14和CK8-18双阳性。与迄今为止在培养中描述的所有上皮细胞相比，但与上述报道一致的是，克隆基因TEC稳定地共表达间质标记物，如CD90、VIM和TE7（图3b）。此外，一些表达TP63(一种层状上皮基底层的转录因子，胸腺上皮细胞的主调节因子)的TEC在体内外也对VIM呈阳性反应(图3a,b)。体外培养TEC的全基因组转录组分析证实了scRNA测序定义的EMT特征在体外的表达，间充质标记物的表达也与间充质细胞的典型的高运动性和迁移相关，培养4天的TEC菌落的活体成像证明了这一点。因此，上皮细胞的混合上皮-间充质表型似乎是胸腺在体内和体外高度独特的特征。免疫荧光显示间质标志物TE7、VIM、PDGFRβ、硫酸软骨素蛋白多糖4 (NG2)和平滑肌肌动蛋白的表达。最后，作者通过全基因组RNA测序比较了培养的上皮克隆原性细胞和胸腺间质细胞的转录谱，这些细胞来自不同年龄的儿科样本，正如预期的那样，主成分分析表明（图3c），培养的TEC与TIC明显不同。然而数据证实，两种细胞类型在EMT相关基因的表达上也有非常相似的地方，包括高表达COL1A1, MMP2,TGFBR2和FN1（图3d）。图3cd.体外培养TEC与体外培养TEC的主成分分析及热图4. 自然胸腺支架
考虑到TEC和TIC在所采用的培养条件下的大量扩展能力，可以在相对较短的时间内获得数十亿的TEC和TIC，使它们成为具有临床适用性的假定的干细胞/祖细胞。为了评估它们的功能分化能力，作者开发了一种独特的方法，通过全器官去细胞化获得胸腺细胞外基质(ECM)，这将提供胸腺基质的3D结构，并根据生理模式引导细胞重组。胸腺从第三咽囊发育而来，是独立的肺叶，肺叶作为独立的血管结构迁移到它们最终的位置，之后，肺叶通过一层结缔组织相互粘附，由于缺乏对整个器官的主要动脉供血，迄今为止还不可能应用灌注-去细胞化方法从胸腺获得ECM支架，因此，作者开发了一种允许胸腺全器官灌注的新方法。简单地说，一个颈动脉被打开以允许器官的灌注，而所有其他动脉(到达胸腺的血管出现的下游)被关闭。并证明了这种显微外科手术方法允许通过单个套管注射Microfil®化合物灌注两个胸腺，固化和固定后，作者通过Micro-CT对整个器官成像（图4），胸腺ECM的特征是对ECM蛋白进行比色染色，证明弹性蛋白保留，同时确认中间丝(包括角蛋白)的缺失，同样，脱细胞后基本上没有残余DNA，扫描电子显微镜(SEM)显示了ECM纤维在高分辨率下的分布，并保存在经γ辐射灭菌的全器官支架中，并可存储在生理溶液中。5.天然支架促进体内功能性胸腺形态形成
接下来，作者研究了如上所述广泛扩张的上皮性胸腺细胞在体外全器官3D天然支架内的再生和生长能力。注射4-6百万克隆基因TEC，扩展4-6周。再填充的支架在上皮培养基中静态维持14天，在此期间，他们显示支架重塑和逐渐增加的体积。对重新填充支架的扫描电镜证实了TEC、TIC和脱细胞ECM之间的细胞-细胞和细胞-基质相互作用，以及血管结构的保存，接下来，作者认为将克隆原细胞在体外重组的有组织胸腺基质与在海绵上培养达21天的临床胸腺切片进行比较是合适的，摘除供体胸腺细胞，然后再移植到无胸腺的病人身上，考虑到目前的胸腺切片制备临床规程显示基质组织紊乱，培养14天和21天后存活率变化，以及同样重要的残留，支架内重组基质的健康状况似乎特别重要，CD3+胸腺细胞对移植受体具有明显的移植物抗宿主病风险，为了评估3D胸腺微环境的功能潜力，如前所述，在天然支架上重新填充TEC和TIC，并培养4-6天，然后注射胸腺细胞前体。考虑到重新填充支架的大小(0.5-1 cm3)，培养细胞的时间相对较短(最多2周)，相对于造血干细胞(HSC)谱系分化所需的5-6周时间。总之，培养器官大小、3D结构支持胸腺基质细胞的生存和适当的空间组织，进而促进胸腺细胞分化是可能的。6.人胸腺形态形成在体内再现
接下来，作者研究了重新填充的胸腺支架是否可以在体内成熟并维持由星状细胞重组的人类T细胞。为了确定植入支架的功能特征，移植物被收集，分离成单个细胞，并通过流式细胞仪进行分析。在重组胸腺植入体的hCD45+人群中，CD3+细胞是普遍的表型，最后，作者研究了重新填充支架的能力，以支持无胸腺NSGFoxn1null (nsg-裸)小鼠的外周T细胞重组，其中支架是唯一的胸腺基质。BM重建时，在空支架移植后的小鼠外周血中没有T细胞(hCD3+)的表达。相反，当nsg -裸鼠移植之前在体外重新填充人胸腺基质的支架时，在周围检测到hCD3+细胞。