宏基因二代测序在经验性治疗失败肺部感染患者中的应用
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本研究分析64例经验性治疗失败肺部感染患者的临床资料，并对比mNGS检测与传统病原学检测的优劣，进一步探讨支气管肺泡灌洗液（BALF）mNGS在经验性治疗失败肺部感染患者的临床应用价值。
资料与方法
1．一般资料：
采用回顾性研究的方法，选取2021年9月至2023年11月我院收治的行BALF mNGS检查的64例经验性治疗失败肺部感染患者的临床资料，纳入标准：年龄≥18岁；符合社区获得性肺炎（CAP） [ 6 ]或医院获得性肺炎（HAP） [ 7 ]或重症肺炎的诊断标准 [ 7 ]；均行传统病原学检测及BALF mNGS检查并自愿签署支气管镜及mNGS检测的知情同意书。排除标准：合并肺外感染；妊娠或哺乳期妇女；临床资料及实验室资料不完整；经初始经验性治疗72 h有效；样本未通过mNGS质量控制。本研究经我院伦理委员会审核通过（批准号：SH9H-2024-T112-1）。
2．方法：
传统病原学检测：收集深部痰标本，其中痰液由患者清水漱口2 ~ 3次后，留取深部痰液5～10 ml送检，无法咳痰者用配置痰液收集器的一次性吸痰管辅助吸痰，1～2 h送至检验科实验室进行微生物的涂片、培养及药敏试验等检测。同时依据临床诊治完成真菌-D葡聚糖试验（Ｇ试验）、曲霉菌半乳糖苷酶（GM试验）、结核感染T细胞等常规检测。（1）BALF采集：做好术前相关准备工作，严格遵守无菌操作原则。依据胸部CT选择病变最显著部位灌洗，快速注入0.9%氯化钠进行多次灌洗，每次注入20 ~ 50 ml，常规灌洗3 ~ 5次，总量控制在60 ~ 120 ml。通过负压吸引回收肺泡灌洗液，弃去第1管可能被污染的回收液，再回收等量（5 ml）肺泡灌洗液样品2份，分别用两个灭菌容器分装。一份送我院检验科行传统培养，另一份送至我院病理科实验室进行mNGS检测。（2）mNGS检测：基于标本中病原体核酸成分及游离核酸，采用基于Illumina测序平台的高通量测序技术来检测，使用病原体专用数据库比对分析，从而鉴定样本中的致病菌，检测步骤：取0.5 ml肺泡灌洗液临床样本前处理、提取核酸、合成cDNA、文库制备、测序、分析和结果报告解读，从而得到mNGS检测阳性结果 [ 8 ]。本研究检测样本的DNA/RNA测序。（3）mNGS检测报告解读：由于目前尚无mNGS的报告解读标准，可以参考《中国宏基因组学第二代测序技术检测感染病原体的临床应用专家共识》的推荐意见 [ 5 ]，根据微生物检出序列数、实验室指标、影像学变化、临床表现及疗效进行综合判读 [ 8 ]，前提是排除背景菌、污染菌和定植菌的情况下。对于胞内菌和厚壁微生物，即使检测序列数不高也考虑为致病菌。
3．统计学方法：
采用SPSS 26.0软件进行统计分析，符合正态分布计量资料以 ± s表示，非正态分布计量资料以 M（ Q 1， Q 3）表示；计数资料以例或百分比表示，比较采用 χ 2检验，采用McNemar检验比较两种检测方法阳性率。 P<0.05为差异有统计学意义。
结果
1．临床基线资料：
64例经验性治疗失败肺部感染患者，男31例，女33例，年龄（61.40 ± 13.04）岁。合并高血压22例，合并糖尿病8例，合并冠心病6例，合并肺外恶性肿瘤12例。见 表1 。
2．mNGS检测与传统病原学检测肺部感染阳性率比较：
64例患者通过mNGS检测耗时仅1 d，其中56例阳性，8例阴性，mNGS检测的阳性率高达87.50%（56/64）。相比之下，传统病原学检测需要3～4 d完成，其中37例阳性，27例阴性，阳性率为57.81%（37/64）。两种检测方法有36例患者均为阳性，而7例患者均为阴性。因此，可以得出结论，mNGS检测的阳性率高于传统病原学检测，差异有统计学意义（ P<0.01）。以传统病原学检测作为"金标准"，计算mNGS在经验性治疗失败肺部感染诊断中的灵敏度为97.30%，特异度为25.93%，阳性预测值为64.29%，阴性预测值为87.50%，两种方法的 Kappa一致性系数是0.257。见 表2 。
两种检测方法结果均为阳性的36例中，有3例检测结果完全一致，17例检测结果部分相同，16例检测结果完全不一致。见 图1 。
3．mNGS检测与传统病原学检测检出病原菌分布情况：
mNGS检测呈阳性的患者中共检测出53种病原菌，即162株病原菌，包括70株细菌（43.21%），32株真菌（19.75%）和53株病毒（32.72%），可见mNGS检测细菌的能力最强，而真菌检测能力最弱。其中细菌检出率占据前三名的分别是铜假单胞菌15例（23.44%），肺炎克雷伯菌15例（23.44%），副流感嗜血杆菌5例（7.81%），均为革兰阴性菌；真菌分别是白色念珠菌13例（20.31%），耶氏肺孢子菌6例（9.38%），烟曲霉5例（7.81%）；病毒分别是人类疱疹病毒4型19例（29.69%），人巨细胞病毒8例（12.5%），人类疱疹病毒1型5例（7.81%）。而在传统病原学检测结果呈阳性的37例患者中，共检测出10种病原菌（即50株病原菌），包括6种细菌、4种真菌，其中细菌检出率占据前三名的分别是铜绿假单胞菌7例（10.94%），肺炎克雷伯菌3例（4.69%），嗜麦芽窄食单胞菌2例（3.13%），鲍曼不动杆菌2例（3.13%），均为革兰阴性菌；真菌分别是白色念珠菌26例（40.63%），丝状真菌生长4例（6.25%），光滑念珠菌3例（4.69%）。在微生物检测方面，mNGS比传统病原学检测具有更高的敏感性和准确性，能够检测出更多的微生物种类及数量。并且可以检测出如鸟型分枝杆菌、惠普尔养障菌、细小脲原体、巴西诺卡菌等传统病原学检测方法难以检测的罕见病原体。见 图2 、 图3 。
4．两种检测方法检出混合感染比较：
56例mNGS检测阳性中检出混合感染42例，检出率为65.63%（42/64），前3种类型为细菌+真菌+病毒混合感染12例，细菌+病毒混合感染8例，细菌混合感染5例。37例传统病原学检测阳性中检出10例混合感染，检出率为15.63%（10/64），以细菌+真菌混合感染为主（8例）。mNGS检测对混合感染的检出率高于传统病原学检测方法，差异有统计学意义（ χ 2 = 33.17， P<0.01）。
5．mNGS检测对临床治疗方案的影响：
64例患者通过mNGS检测发现56例患者呈阳性，其中36例患者根据mNGS结果调整了抗感染治疗策略，调整抗生素中34例患者调整用药方案后病情好转；20例患者根据mNGS继续当前治疗方案，其中19例患者继续当前治疗方案后病情好转。这表明在经验性治疗失败的肺部感染患者中有56.25%（36/64）的患者根据mNGS检测结果调整了抗生素治疗策略。其中在重症肺炎患者中有高达83.33%的患者接受了mNGS指导的抗感染治疗方案调整，好转率为80%。在20例传统病原学检测结果为阴性而mNGS检测阳性的患者中，10例根据mNGS调整抗生素治疗后，9例患者病情明显好转并顺利出院。
6．mNGS对耐药基因的检测：
56例mNGS检测阳性患者中通过mNGS检测检出耐药基因18例，其中21种耐药基因被检测出，比如超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）基因（TEM、SHV、OXA）、β-内酰胺酶（AmpC、CTX-M）、氨基糖苷类相关耐药基因（APH、ANT、AAC）、喹诺酮类耐药基因（qnr）、大环内酯类相关耐药基因（ErmB、ErmX）、四环素类相关耐药基因（tetM、tetK）、磺胺类抗菌药物耐药基因（sul1）、磷霉素相关耐药基因（FosA/B）、氯霉素耐药基因（catB7/B3、cmx）、外排泵相关耐药基因（MFS、MexEF-OprN）。11例同期经痰液、肺泡灌洗液等标本行常规药敏试验，其中仅5例药敏结果与mNGS结果较为相符。
讨论
近年来，mNGS作为一种快速、客观、全面、精确的新型DNA或RNA测序方法，正逐步被应用于临床感染性疾病病原体诊断中 [ 9 , 10 ]，特别是对于感染病程时间长、传统病原学检测阴性、经验性抗感染治疗失败的患者，行mNGS检测往往有更重要的诊断价值 [ 11 ]。与传统病原学检测相比，mNGS检测具有高通量、广覆盖、快速鉴定、高灵敏度等优点。本研究结果发现在肺泡灌洗液中，mNGS检测阳性率比传统病原学方法要高，而且其所需时间也比传统病原学方法少，说明mNGS检出阳性率和检测速度较传统检测法均占优势，这与先前研究结论一致 [ 12 ]。本研究结果还发现mNGS检测灵敏度高，但是特异度较低，可能原因是mNGS对胞内菌及真菌检测难度大，且无统一的报告解读，说明mNGS检测存在一定的假阳性率且无法完全避免，故进一步提高其在临床诊断应用中的特异性显得尤为重要。另外，mNGS的阴性预测值为87.50%，提示mNGS在排除感染诊断方面具有显著的参考意义。
本研究结果还发现肺炎支原体3例，诺卡菌2例，烟曲霉5例，鸟型分枝杆菌2例等。说明mNGS检测在苛养菌、病毒、罕见病原体的诊断方面具有明显优势 [ 13 ]。其次mNGS检测在混合感染中的检出率高于传统病原学检测法，差异有统计学意义（ P<0.01），不仅说明mNGS技术在检测混合感染方面具有显著优势，也提示在经验性治疗失败肺部感染患者中混合感染的情况较多见，以上结果有利于指导抗生素的精准治疗。
分析肺泡灌洗液mNGS检出的病原体分布时发现，mNGS检测相较于传统病原学方法检测出的病原体种类更全面，其中mNGS和传统病原学法检出的细菌中均以革兰阴性菌为主，这与先前研究一致 [ 14 ]。此外，mNGS检出的位居前3位细菌是：铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、副流感嗜血杆菌，其中铜绿假单胞菌在社区获得性肺炎中少见 [ 6 ]，考虑到可能与本研究中老年患者、合并基础肺病患者居多有关，也很大程度上与目前抗生素耐药菌如铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌耐药性逐渐上升有关 [ 15 ]。以上结果有利于指导经验性治疗失败肺部感染的临床用药。本研究结果还发现，mNGS与传统病原学检测在真菌检出率方面比较差异无统计学意义（ P>0.05），这与相关研究不一致 [ 16 ]。分析可能原因：（1）真菌是厚壁微生物，较难提取核酸，破壁不充分影响mNGS的检出效能。（2）念珠菌多是本次研究中传统法检测真菌假阳性结果的原因，因为念珠菌是分布在口腔和上呼吸道的常见机会致病菌 [ 17 ]。
有研究报道，mNGS技术检测结果受抗感染药物的影响小，可以对肺部感染患者的临床用药提供更准确的指导 [ 18 , 19 ]。在本研究中，有56.25%的经验性治疗失败肺部感染患者根据mNGS结果调整抗菌策略；而有83.33%的重症肺炎患者根据mNGS结果调整抗菌策略，提示mNGS在肺部感染治疗中具有临床指导作用，尤其在重症患者治疗中具有巨大的应用价值。还有研究表明，mNGS技术可以快速检测病原体抗生素耐药基因及毒力因子，尤其是如结核分枝杆菌等传代周期长的微生物 [ 10 ]。正如本研究结果显示，通过mNGS检测出耐药基因的患者例数多于通过传统药敏检测，其次mNGS检测耐药基因的时间为1 ~ 2 d，而传统药敏检测需要3 ~ 5 d甚至更长时间，提示mNGS技术比常规药敏检测在耐药基因检测方面检测灵敏度更高，促进了耐药基因的快速鉴定和特征耐药基因组的发现，进一步协助经验性治疗失败肺部感染患者精准抗感染治疗，从而提高治疗效果。
然而，本研究中肺泡灌洗液mNGS检测微生物阳性率为87.50%，阴性率12.50%，且与传统法检测一致性较差。说明尽管mNGS技术具有较高诊断效能，但同时存在一定局限性：mNGS无法明确区分呼吸道定植菌、背景菌与污染菌，在取样、送检和检测过程中需要严格遵守无菌操作 [ 20 ]；对RNA病毒、胞内菌和有细胞壁的微生物检测的灵敏度较低；缺乏统一的报告解读标准 [ 16 ]；能检测出耐药基因，但无法准确鉴定病原体对抗生素的耐药性 [ 21 , 22 , 23 ]；检测费用较高等。本研究样本量不足，因此需要更大样本量的数据来进行深入分析，以便更全面地了解研究结果；其次，在送检mNGS检测的标本中，检测DNA序列的标本比RNA序列多，存在一定的选择偏倚。
综上所述，与传统病原学检测相比，肺泡灌洗液mNGS技术对致病菌的检出率更高，尤其是对细菌、病毒、分枝杆菌及罕见病原菌等病原体的检出，从而指导抗菌药物的精准治疗，缩短治疗时间，提高治疗效果。但mNGS技术在临床应用中具有一定的局限性，目前无法完全替代传统的病原学检查，相反，可以作为其重要的补充，帮助临床医生更全面地了解患者的感染情况，从而制定治疗方案。对于肺部感染的患者，如果经验性抗感染治疗失败，建议及时采取mNGS和传统病原学检测，以便更有效地进行针对性治疗。
引用：周娟,尤佳琪,尹小燕,等. 宏基因二代测序在经验性治疗失败肺部感染患者中的应用[J]. 中国医师进修杂志,2024,47(08)：679-684.