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2020年6月2日/医麦客新闻 eMedClub News/--免疫疗法具有诱发持久反应的潜力，但是目前只有少数患者有反应。免疫疗法的原发性和继发性耐药的病因是多方面的，不仅源于肿瘤内在因素，还源于癌症与其微环境之间复杂的相互作用。
日前，Cell Research 杂志上发表了一篇“The future of cancer immunotherapy: microenvironment-targeting combinations”综述性文章，该文章在探讨临床免疫治疗的新领域时，描述了两类设计新药物和联合治疗的方法：第一类涉及直接修饰肿瘤，而第二类则通过改变微环境间接增强免疫原性。文章旨在强调靶向肿瘤微环境的组合在未来肿瘤免疫治疗中的潜力以及重要性。通过系统地解决介导耐药性的因素，我们能够确定机制驱动的新方法来改善免疫疗法的疗效。除了手术、化疗、靶向通路抑制和放疗外，免疫治疗已成为癌症治疗的标准支柱。靶向CTLA-4和PD-1/PD-L1的免疫检查点抑制剂（ICI）已被纳入晚期黑色素瘤，默克尔（Merkel）细胞癌，非小细胞肺癌，皮肤鳞状细胞癌，尿路上皮癌，肾癌，难治性霍奇金淋巴瘤，肝细胞癌，胃癌，三阴性乳腺癌和高水平微卫星不稳定性（MSI-H）肿瘤患者的标准治疗方案中。除检查点抑制剂外，还已批准靶向CD19的CAR-T细胞形式的细胞疗法，用于难治性B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）和大B细胞淋巴瘤（LBCL）的患者。另外，目前也正在积极研究新的适应症以及将免疫疗法整合到疾病的早期阶段。▲FDA批准的免疫疗法（图片来源：Cell Research）
临床对免疫治疗的热情很高，很大程度上是归因于其潜在的持久反应，有超过2000个试验正在单独研究抗PD-1/PD-L1靶向药物。然而，只有少数接受免疫检查点抑制剂(ICIs)治疗的患者对这些药物有反应。那些确实有反应的患者中，有一部分后来会继续发展成进行性难治性疾病。原发性和获得性耐药需要新的药物及组合。对免疫疗法的耐药性是多方面的。肿瘤内在因素如PD-L1表达，突变负荷和抗原呈递不足已引起人们的广泛关注，但由于肿瘤存在于动态微环境中，因此免疫治疗耐药性问题更加复杂。肿瘤微环境是由恶性细胞，免疫成分，血管，细胞外基质和信号分子组成的环境，它们可以单独发挥作用，并共同影响对免疫疗法的敏感性。这篇文章中，作者阐述了各种策略来调节微环境，以增强对免疫疗法的反应。这些方法分为两大类：直接和间接调节免疫原性。直接方法主要改变肿瘤本身，而间接方法主要在微环境上起作用。这两种方法之间有着千丝万缕的联系，直接改变肿瘤常常会导致微环境的改变，反之亦然。作者建议将这些分类作为一种手段，以增进对特定策略主要目标的理解，并且指出，微环境靶向疗法与ICI或细胞疗法的合理组合将构成下一代基于免疫的癌症治疗方法。
相互作用的示意图（图片来源：Cell Research）直接肿瘤修饰作用于肿瘤细胞以促进细胞死亡。这些策略包括化疗、放疗、靶向疗法和表观遗传因子。间接修饰的主要作用是改变微环境，以增强抗肿瘤免疫力。这可以通过增强效应T细胞和抗原呈递细胞（APCs）的效力或数量，和/或抑制致耐受性细胞如Treg和MDSC的效力或数量来实现。间接调节剂还可通过修饰肠道菌群，局部脉管系统，细胞因子环境或通过改变细胞代谢（包括氨基酸，葡萄糖和脂质）来改变微环境。下面我们主要详细阐述该综述报道中改变肿瘤微环境（即间接调节）的一些策略。
要优化肿瘤微环境，首先要了解什么是其有利状态。免疫细胞是抗肿瘤反应所必需的，但是它们的存在并不充分，那么其他中间调解物则扮演着关键的决定角色。CD8+效应T细胞（effector CD8+ T cells, Teff）与抗炎细胞因子和促进免疫耐受的细胞竞争，包括骨髓来源的抑制细胞（Myeloid-derived suppressor cells, MDSCs）和调节性T细胞（Tregs）。Teff/Treg比是许多类型肿瘤的预后和预测指标。实体瘤已被分类为“炎症型”（高度浸润了免疫细胞和促炎性细胞因子），“免疫沙漠型”（最小程度的效应免疫细胞浸润）或介于两种状态之间的“免疫排斥型”（基质中存在免疫细胞，但肿瘤实质中不存在）。毫无疑问，“炎症型”肿瘤与更好的临床结果相关。然而，CD8+ 细胞向肿瘤的浸润充其量标志着免疫原性不完全，并且也不是所有“炎症型”的患者都对免疫疗法产生反应。在黑色素瘤患者中，肿瘤内CD8+基线水平与PD-1治疗的反应相关，而抗CTLA-4药物ipilimumab的反应与治疗后肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）的增加更好地相关，而不是基线水平。这就是说，“炎症型”肿瘤表型可以促进反应，但是治疗引起的对免疫原性较低的肿瘤的调节可能产生相似的结果，从而突出了治疗性干预的可能。虽然定义肿瘤及其微环境的免疫原性具有挑战性，但临床研究已验证了几种生物标记。肿瘤内在因素包括PD-L1表达，肿瘤突变负荷和错配修复缺陷在临床上是有用的，但由于它们以肿瘤细胞为中心，因此它们是不完善的生物标志物。现在，我们认识到微环境的关键作用，以及抗PD-1免疫疗法反应的新兴预测因素包括其与T细胞受体(TCR)多样性和/或克隆性、宿主HLA基因型、有利的肠道微生物群、甚至可能由瘦素（ leptin）介导的身体质量指数等的关联。在癌症免疫治疗中，旨在增强天然（native）T细胞对局部诱因的反应的策略是最前沿的。T细胞的反应受到严格的调控，以确保对外来抗原产生免疫反应和预防不受抑制的炎症之间的平衡。这种平衡是由共刺激分子和共抑制分子精心维持的。肿瘤表达的共抑制分子改变了肿瘤微环境的平衡，通过增加Treg浸润和降低Teff活性使天平向免疫抑制倾斜。治疗性干预依赖于共抑制分子的阻断和/或共刺激分子的增强，以建立促免疫原性肿瘤微环境，从而形成了当前免疫治疗策略的基础。PD-1和CTLA-4是免疫检查点中最广为人知的，它们使T细胞丧失对癌症的反应性，并成为肿瘤细胞使免疫系统失去抗肿瘤免疫功能的目标。基于CTLA-4和PD-1/PD-L1抑制剂的成功，更多可供选择的免疫检查点的阻断是广泛的临床前和临床研究的领域。迄今为止，ICIs针对LAG-3（lymphocyte-activation gene 3）（一种在Teff和Tregs上表达的细胞表面分子）的研究是最为深入的领域之一。LAG-3以类似于PD-1的方式抑制Teff活性并上调Treg活性，从而为肿瘤的生长创造了可耐受的微环境。在小鼠模型中，LAG-3的抑制作用与PD-1抑制作用具有协同作用，并能使T细胞对树突状细胞Toll样受体（TLR）疫苗的刺激产生更强烈的反应，这表明共同信号（co-signaling）阻断可以恢复有利的免疫微环境，可以对抗原刺激产生反应。目前至少有60项针对LAG-3的临床试验正在进行中，包括单独治疗和与其他免疫检查点联合，都在等待结果。另一个被广泛研究的介导T细胞衰竭的抑制性检查点是TIM-3（T-cell immunoglobulin and mucin-domain-containing molecule 3），其在多种类型的免疫细胞上表达。TIM-3还具有许多已知的配体，结合半乳糖凝集素9（galectin 9）导致T细胞死亡，而结合CEACAM1似乎会增强耐受性，尽管自相矛盾的是，缺乏CEACAM1的动物模型显示肿瘤生长增加。其他TIM-3配体，包括磷脂酰丝氨酸（PtdSer）和HMGB1，被认为对于树突状细胞的抗原感应和呈递特别重要。TIM-3在TIL上的上调与多种不同类型癌症的不良预后相关，而抗TIM-3似乎能够使产生IFN-γ的CD8+ T细胞激活，尽管可能加剧自身免疫介导的反应，包括肺炎。肺癌的临床前模型表明，TIM-3上调可能是阻断PD-1治疗获得性耐药的机制。TIM-3抑制与抗CTLA-4或抗PD-1的组合已显示出临床前疗效，并且许多临床试验正在进行中。
抑制性检查点是一部分。缺乏共刺激也会导致对肿瘤抗原的无效免疫反应。Theralizumab（TGN1412），CD28的单克隆激动剂，是首次尝试操纵共刺激分子以增强肿瘤反应，导致多个参与者出现严重的细胞因子释放综合征和多器官功能障碍的。毒性的严重性及对其潜在机制的了解不足，削弱了人们对其他共同刺激策略的热情，但最近的突破使该领域重新焕发了活力。已经出现了几个有吸引力的共同刺激目标，包括ICOS（诱导性T细胞共刺激物），CD40，TLR和OX40。 ICOS是CD28超家族的成员，可在活化的T细胞上被诱导表达并调节多种T细胞功能，包括Teff活化，与B细胞的相互作用以及Treg浸润。临床前工作表明，ICOS激动剂适配体可提高体内抗CTLA-4治疗黑色素瘤的功效。目前，针对ICOS的激动剂单克隆抗体联合抗PD-1治疗实体瘤正处于早期临床试验中。
OX40是TNF受体超家族的成员，可促进T细胞的活化，存活，增殖和效应功能。尽管OX40与Treg的发育有关，但OX40的激动作用抑制了Treg的功能。OX40作为单一药物，其增强免疫原性的作用较弱，但增强T细胞库和刺激免疫微环境的组合策略被认为具有更大的前景。到目前为止，OX40组合的临床试验已显示出有限的疗效。到目前为止，OX40联合用药的临床试验效果有限。而除了使用共刺激激动剂作为主要疗法的试验之外，共刺激激动剂的一种有希望的用途是延长过继性T细胞疗法的寿命和功能。
作为免疫激活的关键效应物，增强细胞因子是一种有前途的方法。实际上，一些最早的免疫治疗策略就涉及外源性干扰素和白介素2（IL-2）的使用。这两种疗法的疗效都不明显，并引起明显的毒性，从而限制了它们的临床应用。但是，工程技术的改进引发了人们对使用细胞因子以增强天然T细胞反应的新兴趣。例如NKTR-214，它是IL-2的聚乙二醇化版本，旨在诱导比单独使用IL-2细胞因子小的毒性，并且该制剂在I期试验中是安全的。试验活组织检查显示，免疫浸润增加，并趋向效应表型转变。目前正在进行NKTR-214与PD-1单抗组合（NCT03138889）或与CTLA-4 和PD-1单抗组合（NCT02983045）的几项试验。
增强天然T细胞反应的另一种途径来自对肿瘤微环境内空间关系的认识。双特异性抗体与T细胞结合，同时也与其他免疫效应子结合。这种策略最早的成功是在B细胞白血病患者中使用双特异性抗体blinatumomab，它结合肿瘤细胞上的CD19和T细胞上的CD3。双特异性抗体还正在被设计成结合共刺激和共抑制分子，包括PD-（L）1、4-1BB和LAG-3等，这可能有助于直接增强微环境。
最后，旨在增强先天免疫力的激动剂与适应性免疫激动剂并行开发。TLR指导先天免疫细胞的活性并改变细胞代谢。目前，使用TLR激动剂和拮抗剂的几种治疗方法正处于早期试验阶段。例如，TLR9激动剂CMP-001正作为单一疗法以及与检查点抑制剂联合用于多种实体肿瘤的进行测试（NCT03983668, NCT02680184, NCT03618641等）。同样，TLR9激动剂SD-101正在与抗PD-1治疗(NCT02521870)以及靶向治疗和放疗(NCT02927964)联合研究。
癌症疫苗的目标是通过直接抗原注射或裂解癌细胞以暴露肿瘤内抗原来增加免疫反应。疫苗可以细胞、肽/蛋白质、病毒或DNA / RNA的形式出现。基于细胞的疫苗利用来自单个患者的灭活的完整肿瘤细胞作为抗原。Sipuleucel-T是一种针对去势抵抗性前列腺癌的树突状细胞疫苗，是首个获得FDA批准的基于细胞的疫苗。此外，包括OncoVAX和GVAX在内的其他疫苗正在积极研究中。但从个体患者生产疫苗所涉及的费用和困难限制了该方法的实用性。
蛋白质/多肽疫苗是由20-30个氨基酸序列合成而成，包含抗原的特定表位和佐剂。基于肽的疫苗比基于细胞的疫苗更容易制造，更稳定并且更安全，但是迄今为止它们在临床试验中的表现令人失望。
在基因疫苗中，DNA或RNA可以被包装，由抗原呈递细胞（APC）吸收，并翻译成肿瘤特异性抗原。但遗传物质的有效传递可能存在问题，从而减少蛋白质和抗原呈递的后续翻译。电穿孔或病毒载体的使用可以增强传递，但是这些方法的临床适用性受到限制。
最近的研究主要集中在围绕新生抗原(neoantigens，也称为肿瘤特异性抗原)合成个性化疫苗，这些新生抗原是由癌细胞中的非同义突变或转录错误产生的。下一代测序可以通过比较肿瘤细胞和外周血单核细胞来识别新生抗原，因为新生抗原是肿瘤细胞特有的。要创造一种个性化的癌症疫苗，可以将编码目标抗原的DNA、RNA或多肽与佐剂结合，以增强免疫应答。一旦被捕获，新生抗原就被APC带到淋巴结并呈递给T淋巴细胞，导致新抗原特异性T细胞扩增并向肿瘤迁移。
概念验证研究已经证明了这种方法的可行性和潜在的有效性。在一项I期研究中，使用含有对HLA-A2具有高结合亲和力的新生抗原的树突状细胞，接种疫苗导致CD8+ T细胞对大约一半的免疫原性肽产生特异性扩增。未评估抗肿瘤活性。最近，计算模型被用于识别可能与高危黑素瘤患者的HLA-A或HLA-B蛋白结合的新抗原。6名患者在辅助治疗中接种了具有多达20种个性化新生抗原的疫苗，其中4名患者在中位随访25个月后未复发。
通过鉴定新生抗原并筛选与MHC的结合亲和力，还开发了基于RNA的新生抗原疫苗策略。初步研究表明，T细胞对新抗原的反应强烈。治疗了5例转移性疾病患者，其中2例单独使用疫苗有客观反应，1例对疫苗加抗PD-1疗法的完全反应。尽管这些研究规模很小，但令人信服的结果表明，个性化的癌症疫苗可能会成为未来免疫治疗方案的重要组成部分。
另一种增强肿瘤抗原识别和增强T细胞反应的策略是直接将溶瘤病毒引入肿瘤微环境。溶瘤病毒首先在肿瘤细胞中感染或复制，后续的抗肿瘤作用包括：（1）通过细胞内增殖诱导肿瘤细胞裂解；（2）释放细胞因子和病毒病原体相关分子模式（PAMPs），增强CD8 T细胞活化；以及（3）NK细胞介导的先天性免疫应答。这些影响不仅在局部可见，而且在远处的位点也有CD8+和肿瘤特异性CD4+细胞增加的报道。
第一种经FDA批准的溶瘤病毒，talimogene laherparepvec（T-VEC）具有多种增强免疫的微环境效应。T-VEC是一种改良的单纯疱疹病毒，用于无法切除的黑色素瘤患者瘤内注射。它引起肿瘤细胞的直接裂解并释放粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），它是促进APC募集，成熟和功能的细胞因子。T-VEC在注射部位和远处的肿瘤部位显示出强大的T细胞反应。
与溶瘤病毒的联合试验是免疫肿瘤学中一个活跃的前沿领域。T-VEC与检查点抑制剂的组合在黑色素瘤中显示出早期有希望的结果。值得注意的是，在T-VEC加pembrolizumab的试验中，应答与基线CD8+ T细胞浸润或干扰素-γ表达无关，但客观反应与治疗后浸润和表达相关，表明T-VEC可能会改变微环境，以增强PD-1反应。
已经采用了类似的策略来创建基于腺病毒的ONCOS-102。腺病毒激活先天免疫系统，包括树突状细胞。ONCOS-102由经工程改造以表达GM-CSF的腺病毒组成，该腺病毒作为单一疗法已显示出初步的抗肿瘤功效。ONCOS-102已与环磷酰胺合用，以上调促炎性免疫成分并使免疫抑制细胞的微环境衰竭。目前正在研究ONCOS-102与环磷酰胺和其他抗癌疗法组合治疗黑色素瘤（NCT03003676），前列腺癌（NCT03514836）和晚期腹膜恶性肿瘤（NCT02963831）。
其他溶瘤病毒，包括牛痘病毒，麻疹病毒，柯萨奇病毒和脊髓灰质炎病毒等，也正在探索当中。针对微环境的其他组成部分也可以增强溶瘤病毒的功效。例如，溶瘤病毒已显示出进一步破坏肿瘤血管的能力，已知该血管在基线时是异常的并且在癌症中的功能较弱。临床前数据表明，药理学上改善肿瘤血管结构可以改善对溶瘤病毒的反应，包括免疫细胞向肿瘤内运输，肿瘤缩小和转移减少。
癌细胞内的表观遗传学改变可能会（至少部分）通过下调有效肿瘤抗原的表达）来消除免疫识别。一个典型的例子是癌睾丸/癌生殖系抗原，NY-ESO-1，它仅在生殖细胞，胎盘和某些肿瘤组织中表达。NY-ESO-1的表达受到DNA甲基化的负调控，而受组蛋白乙酰化的正调控。去甲基化剂可在临床前模型中增加肿瘤细胞中NY-ESO-1的表达并诱导CD8+细胞免疫应答。在临床前卵巢癌模型中，趋化因子的表观遗传调控会改变T细胞的运输，特别是由Th1型趋化因子CXCL9和CXCL10介导的。将表观遗传调节剂与ICI或其他免疫疗法相结合可能是一种有前途的方法。表观遗传修饰剂除了增强抗原表达外，还可以通过增强T细胞的效应功能在肿瘤微环境中发挥双重作用。ICI激活衰竭的T细胞与显著的染色质重构相关，提示表观遗传调控可能对某些T细胞功能衰竭的患者有益。表观遗传调节剂，组蛋白脱乙酰酶（HDAC）抑制剂，可抑制T细胞活化诱导的细胞死亡（AICD），临床前模型表明具有ICI的HDAC抑制剂可阻止T细胞死亡并增强抗肿瘤反应。使用这种方法的临床试验正在进行。表观遗传调节剂也可以介导其他炎性细胞的活性。例如，IFN-γ通过巨噬细胞表观遗传调控似乎既可以促进巨噬细胞炎性表型，又可以抑制抗炎信号。免疫激活被促进免疫耐受和防止失控炎症的微环境因素所抵消。肿瘤采用这些机制来抑制抗肿瘤免疫力。除PD-1和CTLA-4等抑制性检查点外，肿瘤免疫耐受的关键细胞介质是MDSC，Treg，肿瘤相关巨噬细胞和缺陷型APC。MDSC是单核髓系细胞，其在诸如癌症的慢性炎症的情况下出现，以防止组织损伤。 MDSC通过抗原特异性和非特异性机制产生一氧化氮，细胞因子和活性氧，从而抑制T细胞。除了直接抑制T细胞外，MDSC还促进血管生成，代谢以及对化疗，靶向疗法和免疫疗法的抵抗力。实体肿瘤患者较高的MDSC浸润与较差的总生存期（OS）和无进展生存期（PFS）相关。在健康个体中，Treg是自我耐受的关键介质，可消除APC和效应细胞的活性。与MDSC一样，在许多实体瘤中，高浓度的肿瘤浸润Treg与不良预后相关。Treg通过以高亲和力结合IL-2在很大程度上抑制了T细胞应答，从而限制了效应细胞对IL-2的利用。它们还表达CTLA-4并产生免疫抑制性细胞因子，包括IL-10。除了CTLA-4以外，将肿瘤微环境中抑制性细胞的存在或活性降至最低也是研究的活跃领域。几种FDA批准的药物已与癌症患者的MDSC降低相关，包括PDE5抑制剂tadalafil和ATRA（all-trans-retinoic acid ）。肝脏X受体（LXR）的诱导还与体内和体外MDSC消耗有关，目前正在I期临床试验（NCT02922764）中评估LXRβ激动剂RGX-104。关于Treg，糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体相关蛋白（GITR）旨在下调Treg功能，并且目前正在研究这些抗体与PD-1抑制的结合。靶向微环境的细胞成分不是修饰免疫原性的唯一方法。另一个新兴因素是肠道微生物组。由于一些主要的环境因素，包括饮食习惯和抗生素暴露，患者的肠道菌群构成各不相同。虽然已知像幽门螺杆菌这样的肠道细菌会介导癌变，但最近的数据表明细菌也可能改变对包括ICI在内的癌症治疗的反应。理论上的机制包括肿瘤和微生物抗原之间的交叉反应，以及微生物组在促进肠道中树突状细胞因子释放、改变循环淋巴细胞活化方面的作用。在接受抗CTLA-4治疗的小鼠中，抗肿瘤反应需要特定菌群的存在。尤其是，用抗生素治疗的小鼠对抗CTLA-4的治疗没有反应，而接受过细菌管饲的小鼠似乎恢复了反应。同样，口服双歧杆菌可增强黑素瘤小鼠模型中抗PD-L1治疗的功效。对患者粪便的分析表明，对免疫治疗有反应的特定细菌种类有所增加，包括双歧杆菌、肠球菌、Akkermansia和Ruminococci。当免疫治疗反应者的粪便菌群给予荷瘤小鼠时，可观察其ICI治疗反应得到改善。尽管缺乏有关特定细菌种类的数据以及对微生物组如何影响抗肿瘤免疫力的机制理解，但在临床前模型中观察到的ICI治疗反应的改善已引起了临床试验的兴趣（NCT03829111）。合理地操纵微生物群已被证明是复杂的，其中，粪便移植作为一种将不同的细菌生态系统从应答者转移到无应答者的手段，也是人们非常感兴趣的领域。在通过修饰肿瘤免疫微环境，从而间接调节肿瘤免疫原性的策略中，尽管许多策略专注于修饰天然肿瘤微环境，但另一种策略则涉及通过过继性细胞疗法将工程免疫细胞或细胞受体直接输注到患者体内，目的是增加识别肿瘤表达抗原的效应细胞的数量。 与单独努力增强天然免疫细胞的反应相比，外源细胞或细胞成分的输注可能具有多个优势。离体培养的淋巴细胞不会持续暴露于致耐受性的微环境中，并且在重新输注后可能对肿瘤抗原提供更有效的反应。此外，过继性细胞疗法能够选择和扩增针对特定抗原的细胞或细胞成分，从而集中了与肿瘤最相关的效应子。目前正在研究三种主要的过继T细胞疗法类型，包括TIL治疗，CAR-T细胞疗法和TCR工程化的细胞疗法。目前，过继性细胞疗法，尤其使CAR-T疗法，已经取得了临床和商业的初步成功，这一领域也成为各企业在肿瘤免疫治疗领域中进行临床与商业布局的重要领域。在肿瘤免疫治疗的未来：靶向微环境的联合治疗（下）中，我们再为大家详细讲述这一策略在间接调节肿瘤免疫原性中的应用。
参考资料：
https://www.nature.com/articles/s41422-020-0337-2