以MEFV基因为例，教你过表达引物设计及加Flag标签：
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基因过表达（gene overexpression）是将目的基因CDS克隆到相应的质粒上，利用载体骨架上构建的调控元件，使基因可以在人为控制的条件下实现大量转录和翻译，从而实现目的基因的过表达。
首先，以pWPI-eGFP过表达质粒载体为例，教你MEFV基因过表达引物设计及加Flag标签。其空载质粒图如下：
给大家讲解一下质粒上的可调控元件，一般包括如下：
了解了基本结构，我们就可以操作了。以人MEFV基因构建进pWPI-eGFP过表达质粒中，构建PYRIN过表达。
第一步、下载基因MEFV最长转录本的CDS区
首先打开生物医学之家（www.swyxzj.com）官网进入NCBI：
检索该人MEFV基因：
随后在打开的页面，向下滑动，滑到mRNA转录本的地方。如下，我们可以看到该基因有两个转录本。那我们构建过表达一般是构建长的的就行，也就是说将长的转录本的CDS区域构建到质粒载体上就行：
点击进入该转录本后，点击CDS，复制该CDS区域：
随后打开Snapgene软件（点击下载安装包），将序列粘贴进去，并且命名好：
此时我们就可以清楚的看到该基因CDS上有哪些酶切位点：
那么我们还要看我们的空载质粒载体上有哪些酶切位点。在质粒载体的酶切位点选择时，不能选择目的基因里的酶切位点，以免造成目的基因切断的现象。
第二步、选择载体质粒独有的酶切位点
那么，我们这一步要先把我们质粒载体序列下载下来看有哪些酶切位点。首先还是在生物医学之家（www.swyxzj.com）官网进入addgene，并将我们要的载体质粒下载下来：
下载后用Snapgene打开，可以清楚的看到序列：
点击酶可以看到具体的酶切位点：
结合本文的第二张图，元件介绍图。我们可知该载体质粒上有EF1a-F启动子（跟CMV类似）：
我们的基因应该构建到该启动子后面。上图展示该启动子后面带有SwaI、PacI、PmeI。我们一般选择双酶切。同时两个位点之间不能太短，距离应该在9bp以上。因此要么是切开SwaI和PmeI，将目的基因连接进去；要么是切开PacI和PmeI，将目的基因连接进去。
我们回到目的基因CDS序列，发现目的基因上面都没有这三个酶切位点。所以以上两种酶切组合都可以（首先查看载体与目的片段序列的酶切位点，选择不共有的酶切位点作为备选位点，再从中挑选比较常用的位点作为最后的酶切位点）：
在这里，我们选择PacI、PmeI这两个酶切位点。选中后查看序列：
那其实我们要找到载体上有的酶切位点而目的基因CDS区域没有的酶切位点，步骤非常简单。首先，我们看到载体上有3个酶切位点（一般不超过10个）。
随后我们打开目的基因序列，如下将不能切的位点选出来：
我们可以看到目的基因不能切的和空载质粒有的位点：
这样就清楚的知道用哪个酶切位点了。
此外，我们还可以通过Primer Premier 5软件（点击下载安装包）寻找目的基因CDS学列上没有但是空载质粒有的酶切位点。
首先将该CDS序列复制到Primer Premier 5软件中，并按照3个碱基排列：
那前面我们已经知道我们要将该CDS构建在EF1a-F启动子后面的SwaI、PacI、PmeI酶切位点中。那我们就可以点击ENZYME，随后将这SwaI、PacI、PmeI酶切位点一个一个选中并添加到右侧的方框中：
随后我们点击如下点击：
此时软件会告诉我们，CDS序列里面没有的酶切位点和空载质粒中有的酶切位点是哪些。如下，我们这里SwaI、PacI、PmeI三个酶切位点都是只在空载质粒里面存在的：
随后我们在根据实验室已有的酶选择酶切位点。到这里，酶切位点就选择好了。在这里，我们选择PacI、PmeI这两个酶切位点。
第三步、引物设计
现在我们知道CDS和空载质粒酶切位点了，就需要设计引物了。引物设计原则如下（双酶切时要在酶切位点加上保护碱基，以保证最佳的酶切效率，一般头端引物设计中不加尾端保护碱基，尾端的引物设计中不加前端保护碱基）：
保护碱基表格如下：
（在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被限制性核酸内切酶切开，因此在设计PCR引物时，人为的在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。）
引物设计模式图如下：
下面开始设计。首先，我们选择的是前面的PacI和后面的PmeI这两个酶切位点。
首先是上游引物，结合保护碱基表，我们知道PacI这里一共有2个保护碱基+8个酶切位点碱基----CCTTAATTAA（20h酶切效率90%多，反正你选择最高的就行）。
接着我们就回到软件，输入10个N，并点击primer：
点击S，再点击edit：
将刚才的10个碱基粘贴过来：
点击右侧的analyze，我们可以看到GC含量，一般我们是控制在40%-60%之间（同时一般后面要21-23nt是匹配的才行），如果太低或者太高就加一些配对的序列进去：
比如我下面这样，输入一个配对的碱基就analyze一下，看看GC符合吗。
同时我们一般后面要21-23nt是匹配的：
最后如下后点击OK：
随后如下复制上游引物即可:
h-pWPI-EGFP-MEFV-F：
5' CCTTAATTAAATGGCTAAGACCCCTAGTGACCA 3'
接着就是下游引物：如上，我们将MEFV的CDS复制到Primer软件中，粘贴的时候我们选择反向互补：
这个时候我们知道下游引物的酶切位点是PmeI。查阅保护碱基表得知，我们在前面应该加上GTTTAAACGGCGCGCCGG（酶切和尾部保护碱基,18个）的反向互补序列，随后点击primer：
点击S，将酶切和尾部保护碱基（GTTTAAACGGCGCGCCGG）的反向互补序列粘贴进去：
粘贴：
点击analyze，看到GC含量不错，但是我们看到只有5个配对的：
我们一般要22左右，所有我们再在后面加上17个碱基看看，最后根据GC含量加成这样：
复制出来：
h-pWPI-EGFP-MEFV-R：5' CCGGCGCGCCGTTTAAACTCAGTCAGGCCCCTGACCACCCA 3'
所以，最后的两条引物是：
h-pWPI-EGFP-MEFV-F：
5' CCTTAATTAAATGGCTAAGACCCCTAGTGACCA 3'
h-pWPI-EGFP-MEFV-R：5' CCGGCGCGCCGTTTAAACTCAGTCAGGCCCCTGACCACCCA 3'
对应的是（没有加Kozak序列哦）：
如果我们还要加Flag标签（其反向互补序列为：CTTATCGTCGTCATCCTTGTAATC）的话：
h-pWPI-EGFP-MEFV-R：5' CCGGCGCGCCGTTTAAACTCACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCGTCAGGCCCCTGACCACCCA 3'
这样我们PCR出来的产物就带有Flag标签了，后期我们构建过表达后用这种常用的标签抗体做什么实验都非常方便。
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