文献速递 | 低内毒素含量基因工程菌株的使用降低基因治疗制品的免疫原性
重组腺相关病毒(rAAV)载体用于基因治疗的主要挑战是宿主的免疫屏障。rAAV载体的产生通常需要大量的质粒DNA，例如采用三质粒系统质粒转染293细胞系生产rAAV。质粒DNA通常从含有脂多糖（LPS，也称内毒素）污染的DH5α细菌株中分离出来，人们通常使用商用的脂多糖去除试剂盒或二氧化硅基离子交换树脂来纯化质粒DNA，由于LPS是一种化学稳定的分子，对高压、极端温度和pH值具有强抵抗力，内毒素在质粒DNA制备纯化中往往有残留，随后带入rAAV载体制品中，rAAV制品中残留的内毒素可能导致明显的宿主免疫反应，因为即使是输注到体内的制品中内毒素含量低至10个内毒素单位(EU)也能引发机体强烈的过敏反应、脓毒性休克，甚至宿主的死亡。美国食品和药物管理局(FDA)要求输注的基因治疗药物其内毒素含量不得超过2.0 EU/剂量/眼或不超过0.5 EU/mL。
图1. 文章摘要图
在哺乳动物细胞中，Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）识别细菌内毒素，然后通过MyD88（myeloid differentiation primary response gene 88）激活NF-κB（nuclear factor-kappa B）。另外，LPS还可以通过激活Toll/IL-1受体（Toll/interleukin (IL)-1 receptor）来诱导NF-κB。NF-κB是控制一系列炎症细胞因子基因的表达的因子，是抵御入侵抗原的第一道防线。
从制品中去除LPS费时、费力、成本高，且导致被纯化载体回收率差，因此，在源头消除内毒素是很重要的。为此，研究人员对菌株LPS相关基因进行基因改造，通过敲除7个基因(ΔgutQ、ΔkdsD、ΔlpxL、ΔlpxM、ΔPAGP、ΔlpxP和ΔEPTA)，将LPS的多糖链和两个次生酰基链删除，修饰后菌株称为ClearColiK 12菌株，其合成的LididIVA不能被TLR 4所识别，因此不能激活NF-κB通路，不诱发机体产生促炎细胞因子。
图2. 使用ClearColiK 12菌株来源质粒生产的 rAAV-DJ 明显降低了基因载体的免疫原性
Qingyun Zheng et al. 等人使用改造后的ClearColiK 12菌株生产rAAV包装质粒，与DH5a对照菌株相比，其生产的rAAV载体，无论体内感染还是体外感染，都有效降低了机体的免疫反应。（见图2）
虽然在液体培养基中ClearColiK 12菌株生长速度比DH5α菌株慢，但当ClearColiK 12菌株生长至足够密度时，ClearColiK 12菌株的质粒产量与DH5α是相等的。此外，使用ClearColi K12菌株的缺点之一是其电转效率低于常用的DH5α，这在常规实验中可能不会对具体实验造成明显限制，但制备rAAV衣壳突变体的质粒文库用于定向进化时，电转效率低这个就会明显限制其应用，因为在rAAV衣壳定向进化实验中，要求质粒的转化效率尽可能高，这样才可获得足够数量和足够丰度的质粒突变体文库。
总之，研究结果表明使用ClearColi K12菌株可以有效消除基因载体制品中的LPS，其在未来的临床基因载体制品制备中有着广阔的应用前景。
参考资料来源：
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8403685/
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