基于第一代CRISPR/Cas系统的基因编辑技术在生物医学中的应用

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细胞与基因治疗领域

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CRISPR/Cas最初被发现作为原核生物适应性免疫用于识别和切割入侵核酸的保护系统。基于这套保护系统，科学家设计了一系列用于哺乳动物细胞基因组编辑的CRISPR/Cas工具包。SpCas9源自化脓性链球菌，属II型CRISPR系统，是第一个被改造并用于哺乳动物细胞基因组编辑的Cas蛋白[1]。SpCas9依赖于向导 RNA(sgRNA)实现基因组特定核苷酸序列的识别。sgRNA是一种短合成RNA序列，由Cas9结合所必需的支架序列和自定义的约20个核苷酸间隔区（spacer）组成，该间隔区定义了要修饰的基因组靶标。为实现Cas9蛋白基因组特定位点的双链核苷酸切割（DSB），sgRNA中的spacer序列需满足两个条件：（1）其序列无法与除靶向位置的其他基因组DNA互补配对；（2）与spacer序列互补的基因组序列3’端需存在PAM序列。PAM序列可为Cas蛋白结合到基因组DNA提供结合信号，但其具体碱基序列由所用Cas蛋白的类型决定[2]。因此，可以通过简单地改变gRNA 中的spacer序列来改变Cas9蛋白所针对的基因组目标。另外，由于sgRNA与基因组DNA的结合依赖于碱基互补配对，因此CRISPR/Cas技术大大提高了基因编辑的准确性。

Cas9具有两个切割活性中心-RuvC和HNH，负责双链DNA的切割。RuvC突变体Cas9(D10A)仅在靶向链上产生切口，而HNH 突变体Cas9(H840A)仅在非靶向链上产生切口；当同时突变Cas9的两个结构域(D10A和H840A)，可以得到只有DNA结合活性但没有切割活性的dCas9[3]。当野生型Cas9蛋白被sgRNA引导到特定基因组位置后，Cas9蛋白可在PAM序列上游位点特异地切割靶标双链DNA并造成DSB，Cas9介导的DSB随后可通过同源末端连接(NHEJ)或同源定向修复(HDR)途径修复。NHEJ修复会引起插入或者删除错误，从而达到敲除某种基因的目的；而HDR可用于精确的核苷酸序列修饰，例如点突变校正或外源DNA片段插入。第一代CRISPR/Cas系统主要利用gRNA介导的Cas蛋白核酸切割活性在生物医学研究中发挥作用，另外由于dCas9可在gRNA的引导下与特定DNA序列结合但并不表现核酸酶活性，因此dCas9可通过与某些蛋白融合实现基因激活与抑制、表观基因组编辑、细胞染色质成像等各个生物学研究的应用。另外，由于其他CRISPR家族成员也具有类似上述Cas9蛋白特点，基于此，本文将探讨以野生型Cas蛋白和核酸酶失活型Cas蛋白为基础的第一代CRISPR/Cas系统在生物医学中的应用。

1.全基因组敲除筛选

CRISPR/Cas9在sgRNA的引导下可实现基因敲除，通过构建全基因组sgRNA文库并通过慢病毒系统使单个细胞接收不同的gRNA序列，当被基因编辑的细胞受到诸如治疗药物、病毒感染或细胞增殖等选择压力时，导致细胞基于sgRNA扰动后的适应度效应进行相互竞争；这将使在某些基因敲除后，仍能在外界选择压力下存活的细胞群保留下来。最终，通过二代测序技术可鉴定出对某一外界压力敏感的基因[4]。

2.全基因组抑制或过表达筛选

由于dCas9核酸酶活性丧失，因此当dCas9蛋白融合某些转录激活因子（如VPR和VP64）或抑制因子（如KRAB），其可在sgRNA引导下靶向目的基因启动子区域，从而激活或抑制内源基因的表达。通过构建靶向全基因组启动子的sgRNA文库，利用与全基因组敲除筛选相似的策略，即可实现基因的功能挖掘或药物靶点解析[5]。

3.表观遗传学编辑

dCas9可与表观遗传修饰酶来进行融合，直接催化DNA或者组蛋白的表观修饰，调控基因的表达。例如，dCas9与DNA甲基转移酶-DNMT3a融合可实现靶向DNA的胞嘧啶甲基化,介导基因沉默[6]；另外，dCas9与去甲基化酶TET1的催化结构域（CD）融合，可快速实现靶基因启动子的去甲基化，并诱导其表达上调[7]。除此之外，dCas9也可与组蛋白修饰酶如组蛋白乙酰化转移酶p300和组蛋白去甲基化酶1（LSD1）融合，分别调控基因表达的激活和抑制[8-10]。

4.染色质成像

dCas9与荧光蛋白融合表达后，可在靶向基因组特定位置的gRNA引导下，实现活细胞内基因组特定位置的标记。为了增加标记信号，sgRNA可针对靶向目标基因的重复序列，另外还可将GCN4多肽添加到dCas9的C端，同时将荧光蛋白与特异性识别GCN4的单链抗体scFv融合表达，通过这种方式可以将更多的荧光蛋白募集到单个Cas9/gRNA复合物上从而增强所标记位点处的荧光信号[11]。若期望标记的目标基因组无重复序列，为富集更多的阳性信号，通常可针对该基因组设计多个sgRNA，由于不同sgRNA活性存在差异，因此该方法对不含重复序列的基因组标记效率较低。为克服该方法的局限性，研究人员将可被Cas9切割的外源重复序列-CRISPR-Tag整合到目标基因组中，进而介导dCas9-荧光分子被高效募集到特异的基因组位点进行DNA标记[12]。另外，为同时标记基因组多个不同位点，可采用如下两种方法。首先，将不同类型的CRISPR-Cas9同源蛋白分别与不同的荧光蛋白融合表达，在靶向基因组不同位置的sgRNA的作用下，实现基因组不同位置的同时标记。另外，已经发现一些RNA结合蛋白可结合特定的RNA序列，将这些不同RNA结合蛋白的结合序列分别插入靶向不同位置的gRNA序列中，再同时表达与相应RNA结合蛋白融合的各种荧光蛋白，实现在仅使用一种类型dCas9的情况下对不同基因组位点进行标记[13]。基于类似的原理，CRISPR-Cas系统还可实现是mRNA，lncRNA和microRNA的标记[14]。

5.DNA或RNA结合蛋白鉴定

CRISPR-Cas系统还可与邻近标记技术结合实现DNA或RNA结合蛋白鉴定。邻近标记技术依赖于具有邻近标记功能的工具酶，如过氧化氢酶(e.g.APEX, HRP)和生物素连接酶(e.g.BioID,TurboID)等，这些工具酶可将它们附近的蛋白进行生物素化修饰；由于生物素与链霉亲和素具有极高的亲和力，因此生物素化的蛋白可被链霉亲和素磁珠富集。基于该原理，当dCas蛋白如dCas9或dCas13与生物素化修饰工具酶融合表达后，借由sgRNA靶向作用便可将与基因组DNA或RNA结合的蛋白进行生物素标记，之后通过链霉亲和素磁珠富集和质谱鉴定便可明确哪些蛋白可与特定的DNA或RNA结合并发挥作用[15,16]。

6.分子进化

当Cas9(D10A)与人工改造的DNA聚合酶-PolI3M形成融合蛋白，在sgRNA引导下靶向某特定基因区域后，Cas9(D10A)将在sgRNA靶向链位置切割出一个缺口，这将使与其相连的PolI3M和产生缺口的DNA链相互结合，并产生一条新的DNA链以取代原有的DNA链；在PolI3M介导的新链DNA合成过程中会随机引入突变位点信号，之后在内源性DNA连接酶的作用下，便会将携有突变的新链DNA整合到基因组中。基于该原理开发的‘EvolvR’系统可在选定的DNA区域上下350个碱基对内，进行单点突变或复合突变，最终可利用该系统筛选出与外界选择压力相关的基因突变位点[17]。

7.转座介导的片段插入

转座子是可在原核和真核生物基因组上发生位置转换的DNA片段，转座子可在原始位置上进行剪切或复制,并在转座酶辅助下插入到宿主基因组的其他位置,转座子发生位置转移的过程即为转座。当Cas12K或Cascade（包含Cas6、Cas7和Cas8蛋白）与转座酶Tn-7形成融合蛋白后，其可在sgRNA的介导下识别基因组中目标DNA的插入位点，从而使外源DNA插入到基因组中的特定位置。与HDR介导的DNA片段插入相比，该方法不依赖双链DNA断裂且效率远高于传统CRISPR方法；但该方法目前仅在细菌中成功应用，并未实现在哺乳动物细胞中DNA的定向整合[18,19]。

8.大片段DNA序列删除

CRISPR-Cas3系统可在人类基因组中单个CRISPR靶向位点的上游区域实现几百bp到超过100 kb的DNA片段删除。Cas3系统的大范围删除能力可用于切割整合到宿主细胞基因组中的病毒基因组，并为不同病毒感染相关疾病的治疗提供潜在方法[20,21]。

9.记忆储存

为实现记忆存储，首先需要设计出自我靶向的gRNA（self-targetingguide RNA），自我靶向gRNA是可识别编码自身gRNADNA序列的gRNA。在自我靶向gRNA的引导下，Cas9将切割编码这种gRNA的DNA序列，产生一种永久性记录事件发生的突变。这种DNA序列一旦发生突变就会产生新的gRNA来引导Cas9靶向这种新近发生突变的DNA序列，而且只要Cas9是有活性的或者这种自我靶向的RNA仍然表达，就允许突变进一步发生和积累。基于该原理，当Cas9设计成可被TNF-a诱导表达时，每当TNF-a存在时，Cas9便将切割编码某一gRNA的DNA序列，产生突变。随着TNF-α的浓度或处理时间增加，自我靶向gRNA的DNA序列就会积累更多的突变。之后通过DNA测序，根据编码自我靶向gRNA的DNA序列突变位点的多少，就能判断TNF-α的浓度高低或处理时间长短[22]。

10.病毒检测

Cas13a和Cas12a可通过crRNA识别靶向的RNA或DNA序列,触发其对邻近单链RNA或单链DNA的附带切割活性。因此，当携带荧光团和猝灭剂的短单链RNA或单链DNA荧光报告基因被放入Cas13a和Cas12a活性已被触发的反向体系中，报告基因便会被切割以导致猝灭剂与荧光团分离，进而产生荧光信号，通过测定报告基团是否可产生荧光信号，便可确定可被crRNA特性识别的目标RNA或DNA是否存在。基于该原理的SHERLOCK（依赖于Cas13a）和DETECTR（依赖于Cas12a）系统已被应用与包括人类免疫缺陷病毒（HIV）、丙型肝炎病毒（HCV）和新冠病毒（SARS-2）等在内的多种病毒诊断[23,24]。

11.临床试验

目前基于第一代的CRISPR/Cas系统的临床一期试验已经由IntelliaTherapeutics公司率先完成，该试验是针对转甲状腺素蛋白淀粉样变性（ATTR）疾病设计的NTLA-2001疗法，通过利用肝脏特异性脂质纳米颗粒（LNP）将靶向ATTR致病基因-TTR的sgRNA和SpCas9mRNA递送至肝脏。通过单次静脉将NTLA-2001注射至患者体内28天后，患者血浆TTR蛋白可最高降低87%，且未发现严重不良反应[25]。我国于2021年首次批准了基于基因编辑疗法的临床试验-ET-01，用于治疗输血依赖型β地中海贫血。ET-01原液通过采集患者自体动员外周血单个核细胞，富集CD34+细胞群后用CRISPR/Cas9系统编辑BCL11A基因的红系增强子以提高胎儿血红蛋白。

参考文献：

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