rcAAV检测——基因治疗质控新挑战

腺相关病毒（AAV）由于其可以稳定表达治疗基因且无明显不良反应，被誉为基因治疗领域的“明星载体”，以AAV为载体的多种基因治疗药物已经上市。例如以AAV2 为载体治疗遗传性视网膜病变的Luxturna 和以AAV9 为载体治疗脊髓型肌萎缩症（SMA）的Zolgensma，上述药品的上市展现了AAV的强大应用前景，同时其他百多项利用AAV为载体的临床实验也在全球如火如荼的开展。虽然被认为是高安全性的“明星载体”，但近年来，几项AAV临床研究的结果也引起了FDA咨询委员会的关注，相关会议也对其安全性提出异议。2021年在“FDA细胞、组织和基因治疗咨询（CTGTAC）委员会会议“上，与会人员就AAV空衣壳等引起的潜在安全问题展开了激烈的讨论。在讨论的各项安全性问题中，有关复制型腺相关病毒（Replication-CompetentAdeno-Associated Virus，rcAAV）的议题也备受关注。

rcAAV的形成

AAV基因组含有两个开放阅读框，分别编码调节基因（rep）和结构基因（cap），两端为145bp的ITR。ITR是病毒复制和包装必须的顺式作用元件。生产AAV通常使用三质粒共转染法，三个质粒分别为rAAV载体质粒（p-vecter）、AAV辅助质粒（p-AAV)和Ad病毒辅助质粒（p-Ad）。在p-vecter 内，AAV基因组的rep–cap 基因被转基因表达框所替代，Rep和Cap蛋白由p-AAV 反式提供，p-Ad则替代了最初AAV制备中使用的腺病毒，负责提供包装rAAV 所必须的辅助病毒的相应功能。

rcAAV的形成主要是由于rAAV载体质粒和辅助质粒间的同源/非同源重组而引起的，载体质粒中的ITR 在重组中发挥了重要作用。

在长期的研究中，研究者一直认为AAV载体具有无致病性、低免疫原性等优点，前期的啮齿类及灵长类动物的大量临床前研究也从未发现其会引起严重不良反应，但由美国宾州大学主持的治疗血友病的AAV基因药物临床研究中，发生了严重的细胞免疫反应，患者转氨酶水平急剧升高，肝功能受到严重损害，最后临床研究也被迫中止。追溯其原因：载体衣壳蛋白（Cap）是引起细胞免疫毒性的主要元凶，rcAAV也可能是其抗原的供应源之一。Wright在文章中表明，在17 批不同血清型的AAV产品中，可表达cap 基因的rcAAV 污染率可达0.4％~1.0％，如采用非优化工艺进行生产污染率则可高达10％。另外，有动物实验研究表明，包装有其他DNA杂质的rcAAV有致瘤性风险或引入抗生素抗性的潜在风险，故rcAVV 检测是AAV药物安全性的重要指标，目前rcAAV的常见的检测方法有点杂交法（Dot-blot）和PCR法。

1.点杂交法：

点杂交法是一种较为早期的定量方法，将靶标DNA吸附结合到硝酸纤维膜或尼龙膜上后，采用标记的不同序列特异性探针与AAV插入的DNA片段杂交结合，最后通过荧光或显色的方式测定。由于杂交溶液中一些成分会干扰基因组DNA与硝酸纤维膜或尼龙膜结合等因素，导致其实验的差异性较高，加之其操作繁琐，试剂昂贵等因素，逐步被目前其它检测方法取代。

2.PCR法：

PCR法因为操作简单、重复性好和经济等因素是目前检测AAV滴度最广泛的方法。PCR法目前常用的包括实时荧光定量PCR（quantitative PCR, qPCR）法和微滴式数字PCR（Droplet Digital PCR，ddPCR）法，qPCR作为第二代PCR方法，目前是各个研究机构及其药企采用最广泛的AAV滴度定量方法，而微滴式数字PCR（ddPCR）被称为第三代PCR技术，作为一种新兴技术与旧的PCR技术（例如qPCR）相比，可针对核酸分子做更精确的定量分析。

微滴式数字PCR的创新之处在于标准PCR反应体系经过微滴发生，将目标分子稀释到多个微滴中，每个微滴大体上只包含一个或不包含目标DNA模板，实现”单分子模板PCR扩增”，扩增结束后含有目标分子模板的微滴会给出荧光信号，最终根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，分析软件可计算给出目的分子的浓度或拷贝数。因此，无需标准曲线即可对目标分子进行绝对定量。

与qPCR相比，ddPCR不需要依赖多个扩增循环来确定每个样品中相对于标准曲线的核酸含量，即ddPCR允许对样品中存在的目标核酸分子进行绝对而非相对标曲的“相对”定量及相对内参的相对定量。qPCR结果的准确性、精确度与实验中使用的标准曲线直接相关，目标分子定量结果的准确性将取决于标准曲线的优化情况。综上所述，相对于传统的qPCR方法，ddPCR在定量准确性、灵敏度及稳定性方面具有显着优势。

以rcAAV检测为例：现阶段，使用qPCR法检测rcAAV限度值的居多。在检测过程中，首先要在辅助病毒存在的条件下，经过多轮感染靶细胞，然后进行基因组DNA提取，最后采用qPCR法测定AAV相关基因，对rcAAV的限度进行检测，如已进入临床实验的rAAV制品scAAV2/8-LP1-hFIX就是采用的上述方法定量rcAAV的含量。据调研，但也有业内人士进行ddPCR方法的开发。

宜明细胞完善的rcAAV检测平台
随着生产工艺的放大，在一致水平的前提下保证AAV产品的安全性、有效剂量变得更加具有挑战性，生产过程中对于AAV的特定质量属性的监控检测就尤显重要，宜明细胞采用qPCR法已建立了完善的rcAAV检测体系，目前已完成了多种血清型的检测方法开发，部分数据展示如下：

不同血清型rcAAV含量检测结果

样品	血清型	rcAAV含量
A	AAV2	<1copy/1.13E+10vg
B	AAV8	<1copy/1.39E+10vg
C	AAV8	<1copy/1.18E+11vg
D	AAV9	<1copy/2.15E+10vg

宜明细胞凭借在病毒载体多年的研发生产经验、多批次GMP病毒产品的成功放行经验及技术积累，宜明细胞逐渐建立完善的AAV工艺质量体系，并不断促进开发新的工艺解决办法，降低成本，提高速度和质量。在积累国内成功申报经验的同时，宜明细胞也可提供中美双报服务，宜明细胞的苏州制备基地完全按照符合NMPA和FDA、EMA规定的标准进行硬件建设，切实为客户进行多国（地）申报提供高效服务。宜明细胞未来始终秉承“让生命更健康，让世界更美好”的使命，全方位为药企提供临床样品的一体化CRO前端+CDMO解决方案，最终使更多疾病患者临床受益。

参考文献：

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