基因编辑技术的应用亮点和未来发展趋势
1、什么是基因编辑
基因编辑是一种新兴的能够较为精确的对生物体基因组特定目标基因进行修饰的基因工程技术。基因编辑工具是一个由序列特异性的DNA结合结构域和非特异性的DNA修饰结构域组合而成的序列特异性核酸内切酶，基因编辑的过程可以概括为一找、二剪、三修补，识别染色体上的DNA靶位点（找），进行切割并产生DNA双链断裂（剪），诱导DNA的损伤修复（修补），从而实现对指定基因组的定向编辑。简单来说，基因编辑就是利用一个经过改造的蛋白作为工具，对指定的基因进行定向改造。
❶ 第一代基因编辑技术—ZFNs技术
ZFNs（锌指核酸酶）技术是第一代基因组编辑技术，其功能的实现是基于具有独特的DNA序列识别的锌指蛋白（ZFP）发展起来的。ZFNs由特异性识别序列的锌指蛋白(ZFP)和FokI核酸内切酶组成。其中，由ZFP构成的DNA识别域能识别DNA的特异位点并与之结合，而由FokI构成的切割域能执行剪切功能，两者结合可使靶位点的双链DNA断裂(DSB)。于是，细胞可以通过同源重组(HR)修复机制和非同源末端连接(NHEJ)修复机制来修复DNA。HR修复有可能会对靶标位点进行恢复修饰或者插入修饰，而NHEJ修复极易发生插入突变或缺失突变。两者都可造成移码突变，因此达到基因敲除的目的。
图：ZFNs作用原理（资料来源：根据公开资料整理）
❷ 第二代基因编辑技术—TALENs技术
TALENs（转录激活因子效应物）是继ZFNs之后的另一种较为灵活和高效的靶向编辑技术，TALENs在结构上与ZFNs类似，是由特异性的DNA结合蛋白-TALE蛋白和FokⅠ核酸酶两部分组成。TALE蛋白是植物病原体-黄单胞菌分泌的一种转录激活因子效应物，是一类分泌蛋白，在植物细胞中能够特异性地识别并结合寄主靶基因的序列，从而调控寄主的基因表达。进行基因编辑时，两个TALE蛋白识别和结合DNA靶位点，FokⅠ核酸酶负责对靶DNA进行切割，从而造成DNA的DSBs，诱发细胞的DNA损伤修复机制，从而实现对基因组靶位点的编辑。
TALENs的合成与组装相对于ZFNs要简单和灵活，其关键是要合成TALE蛋白串联重复区的编码DNA序列，理论上将多个TALE重复单元编码的DNA序列通过多次连接即可实现，但是要合成这种高度重复序列也具有一定的困难和挑战。目前，已经开发出多种快速、简便合成和组装TALENs方法，如Golden gate (GG)组装法、快速高通量固相合成法等。
图：TALENs作用原理（资料来源：根据公开资料整理）
❸ 第三代基因编辑技术—CRISPR-Cas技术
CRISPR-Cas技术是基于原核生物(细菌和古生菌)一种免疫系统而开发的，称之为Clustered regularly interspaced short palindro- mic repeats-CRISPR-associated proteins (规律成簇间隔短回文重复及其相关蛋白)，简称CRISPR-Cas系统。由于该技术合成简单、周期短、操作灵活、效率高等优点，目前备受人们关注。CRISPR-Cas工作原理如下1. sgRNA与Cas蛋白结合，形成核糖核蛋白（RNP）复合物2. RNP复合物在sgRNA的引导下，定位到基因组上的靶位点。3. Cas蛋白会识别原间隔基序(protospacer adjacent motif，简称 PAM)，对靶位点的DNA双链进行切割，产生双链断裂（DSB）。4. DSB引起细胞的紧急修复机制：非同源末端连接（NHEJ）修复或者同源重组修复（HDR）5. 绝大多数情况下（>80%），细胞采用NHEJ修复路径，使得靶位点位置随机产生个别碱基的删除或插入（Indel），得到基因敲除模型。6. 极少数情况下（<20%），且细胞内存在同源片段时，细胞采用HDR修复路径，使得靶位点产生精确修复。7. 在同源片段中引入外源基因片段或者突变碱基，可得到基因定点插入模型或者基因定点突变模型
图：CRISPR/Cas9作用原理（资料来源：根据公开资料整理）
❹ 三种基因编辑技术的比较
作为革命性的基因编辑技术，CRISPR/Cas的优势非常明显，相较于ZFNs和TALENs，CRISPR/Cas的设计难度和构建难度都要小的多，成本更低，开发周期更短，靶向修饰效率更高，此外CRISPR/Cas还具有可以多靶点编辑和可以编辑RNA的优势，这是前两种技术所不具备的。但是CRISPR/Cas有一个明显的缺点，如果靶基因附近没有PAM则无法实现对靶基因的编辑。ZFNs技术作为开发时间最久的基因编辑技术，已经积累了大量临床试验数据，在应用于药物研发方面更为成熟。
图：三种基因编辑技术比较（资料来源：根据公开资料整理）
2、基因编辑技术的应用亮点
❶ 治疗遗传病的技术和成本优势
治疗遗传病的药物有很多种类，其中最为重要的一种就是基于AAV载体的遗传病治疗药物，但是这类药物有两个缺点，一是售价高，二是AAV载体包装能力有限，如前文所述， Spark公司的AAV基因疗法，通过腺相关病毒AAV，将正确的RPE65基因递送到视网膜细胞，从而治疗Leber先天性黑蒙2型，该疗法是FDA批准的首个基因疗法，售价高达85万美元/年。然而，这一方法却对Leber先天性黑蒙10型（LCA10）无能为力，因为CEP290基因的编码序列长达7.5kb，远超AAV病毒的包装能力极限（4.7kb）。而基因编辑药物可以编辑更长的基因序列，成本也要低得多。
❷ 提高CAR-T细胞的制备效率和功能
CAR-T细胞疗法通过采集患者身体内的T细胞，然后经过携带CAR基因的病毒改造后回输到人的体内，达到治疗癌症的目的，原始的制备方法用时长、难度高、成本大，还有可能会引起人的自身免疫反应。基因编辑可以显著提高CAR-T细胞的制备能力和效率。我国科学家王皓毅研究组2016年利用CRIPSR/Cas9技术对CAR-T细胞进行了TRAC、B2M双基因敲除和TRAC、B2M和PD-1的三基因敲除，大大降低了自身免疫原性显著提高了CAR-T抗肿瘤活性；2017年国外课题组同样利用CRISPR/Cas9技术敲除TCR和HLA-I相关基因，敲除后的CAR-T未观察到GVHD；此外，在临床上也有报道接受UCAR-T治疗成功的案例。
❸ 为治愈HIV带来曙光
2019年，美国坦普尔大学和内布拉斯加大学医学中心的研究团队称，他们能够使用CRISPR/Cas技术在人源化小鼠身上摧毁HIV，这是人类首次证明HIV是可以被治愈的。
同年，中国科学家对人类干细胞进行体外基因编辑，使其天然能够抵御HIV，并将其移植到一名罹患血液系统肿瘤的HIV感染者身上。经基因编辑的细胞在患者体内持续存活了一年多且未引起明显副作用，但细胞数量较少，不足以降低血液中HIV的病毒载量。
❹ 应用于诊断试剂的低成、本高效率等优势
2020年12月由杭州众测生物研发的新型冠状病毒 2019-nCov 核酸检测试剂盒（CRISPR 免疫层析法）获批，是国内首次批准利用 CRISPR 技术的新冠病毒检测试剂盒。
在IVD领域CRISPR技术相较于PCR技术有诸多优势：CRISPR诊断特异性极好，可以检测到一个碱基的突变，非常适合早期筛查肿瘤、检测肿瘤易感基因和致病基因。同时，CRISPR诊断技术操作简单、对仪器设备依赖性低、价格低廉，适合野外检测和不发达地区检测；例如国内某兽医科研单位基于CRISPR建立适合养殖场净化的诊断方法，刚果民主共和国利用CRISPR分子诊断技术检测埃博拉病毒。另外，CRISPR诊断对操作者的要求低、结果可视化，因此家庭用CRISPR诊断试剂盒也是许多公司发展的方向。
图：CRISPR分子诊断技术和PCR技术比较（资料来源：根据公开资料整理）
❺ 构建新型模式动物
以前通过基因编辑的方法构建灵长类动物疾病模型几乎是不可能的事，而灵长类动物疾病模型对于医药研发非常重要。CRISPR/Cas技术诞生后，人们可以轻易的实现灵长类动物的基因编辑，从而构建出各种各样的疾病模型。
3、基因编辑的技术发展趋势
❶ ZFNs和TALENs不断降低成本，缩短开发周期
相较于CRISPR，ZFNs和TALENs明显的缺点是构建复杂，开发周期长，成本高，未来弥补这方面的缺陷是这两种技术未来发展的主要趋势。ZFNs的领导者Sangamo表示，在过去，ZFNs的开发周期可能长达三个月，而确定最终治疗ZFNs通常耗时一年。经过改进后，开发周期已经缩短到10天，在此期间，细胞中的构建体被设计、组装和测试，最终生产治疗ZFN所需的总时间已经缩短至3个月。
❷ CRISPR 基因编辑不受PAM限制，实现任意基因组位点编辑
CRISPR-Cas9有一个明显的短板，不能对不在 PAM 序列附近的基因进行编辑。为了克服这个障碍，由 MGH 基因组医学中心的生物化学家Benjamin P. Kleinstiver领导的研究小组，设计了一种 Cas9蛋白的变种，它不需要特定的 PAM 来结合和切割 DNA。这两种新的Cas9变种，分别命名为 SpG和SpRY，允许编辑 DNA 序列，其效率是传统的CRISPR-Cas9酶无法达到的。
❸ 克服脱靶率
ZFNs和CRISPR/Cas都会面临脱靶率高的问题。2016年，Sangamo 在Nature Communications上发表了一篇论文，他们开发了一个系统，可以选择以高比率在正确的位置切割基因的ZFNs，即使在非常高的靶向活性下，仍然保证脱靶率降至检测限水平或者更低。CRISPR/Cas脱靶率的高低关键在于gRNA的设计，gRNA和非目标区域过多的非特异性结果，脱靶效率较高，特别是靠近PAM的8-10bp不能和非目的区有高同源性。目前为了提高基因组编辑的准确性，对Cas9核酸酶进行了突变，突变后的Cas只能切割DNA双链中的一条链，通过两个gRNA引导Cas对DNA切割，可以显著提高基因组编辑的特异性，降低脱靶率。
来源：中关村产业研究院
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