来源/ 公众号细胞与基因线路设计
嵌合抗原受体(CARs)是一种人工合成的受体，可以引导淋巴细胞识别并消除表达靶向配体的细胞。针对癌细胞的CAR-T细胞是这项技术研究最广泛的形式。自体靶向CD19 CAR-T细胞的过继转移成为FDA批准使用的第一个具有基因工程成分的治疗方法。研究人员正试图扩大CAR-T细胞的疗效和许多其他类型的抗癌组合疗法或通过创新CAR设计，解决与当前批准的制剂相关的安全和生产问题以及提高其疗效克服治疗阻力。与此同时，新的CAR-T工程策略正在开发中，以扩大CAR-T细胞在其他恶性肿瘤(包括实体肿瘤)患者中的临床成功。发表在《Nature Reviews | Clinical Oncology》的综述“Engineering strategies to overcome the current roadblocks in CAR T cell therapy”概述了基本的CAR-T设计，并讨论了用于治疗血液瘤和实体瘤的更安全、更有效的CAR-T细胞的新策略。CAR有四个主要组件的模块化设计：抗原结合结构域，铰链，跨膜域和胞内信号域(图1)。这些成分中的每一个都有其独特的功能，优化CAR的分子设计可以通过多种不同的成分组合来实现。 图1. CAR分子设计蓝图
抗原结合区域是CAR-T细胞的胞外部分，它可以识别目标抗原，并相应地改变表达CAR-T细胞的特异性(图1)。CAR-T细胞的抗原结合区域传统上由单克隆抗体的可变重链(VH)和可变轻链(VL)组成，通过柔性连接片段连接形成单链可变抗体(scFv)。单链抗体的某些特性可以对CAR的功能产生影响，而不仅仅是识别和结合目标抗原。例如，VH链和VL链之间的相互作用模式，以及决定互补区域的相对位置，可以影响CAR对其目标抗原的特异性和亲和力。单链抗体对目标抗原的亲和力是CAR功能的一个基本决定因素，然而，过高的亲和力可能导致CAR表达细胞的激活诱导细胞死亡(AICD)，并可能导致毒性。使用不同的单链抗体对相同的目标蛋白具有相似的亲和力，可能会对CAR-T细胞的功能产生不同的影响，这增加了CAR-T设计的复杂性。靶抗原密度和表位位置也是确定理想单链抗体用于CAR工程的关键因素，以便优化CAR与靶标的结合。最后，某些单链抗体与配体非依赖的信号有关，这已被证明在临床前模型中通过导致末端效应T细胞分化、衰竭和/或AICD降低了CAR-T细胞治疗的疗效。除单链抗体外的分子已被用作CARs的替代抗原结合域。例如，zetakine CARs包含融合到细胞内信号域的细胞因子，已经在临床研究中被测试。其他以配体为基础的CARs正在一系列恶性肿瘤的临床前和临床研究中进行测试。最后，表达CARs的T细胞具有全新开发的肽域，用于结合特定抗原，已显示出临床前疗效。CARs的铰链和跨膜结构域连接细胞外抗原结合域和细胞内信号域。铰链提供了足够的灵活性，以克服空间障碍和足够的长度，以方便接近目标抗原。铰链长度和组成的差异可以影响抗原结合和通过CAR信号转导。铰链结构域和跨膜结构域的特性也影响CAR-T细胞细胞因子的产生和AICD。来自CD8, CD28, IgG1或IgG4的氨基酸序列已经被用于CAR铰链结构域(图1)。跨膜结构域通常来源于I型蛋白，如CD3ζ，CD28, CD4或CD8α(图1)，并将CAR锚定在T细胞膜上。使用的跨膜结构域影响CAR的稳定性和功能。具有CD8α铰链和跨膜结构域的CAR-T细胞已被证明释放较少的IFNγ和TNF，并且比那些这些结构域来源于CD28的CAR-T细胞对AICD更不敏感。CAR的第四部分，即细胞内信号域，通常包括一个激活域和一个或多个共刺激域(图1)。绝大多数CAR通过CD3ζ衍生的免疫受体中的基于酪氨酸的激活基元激活CAR-T细胞。然而，仅由这些基序介导的信号传导不足以诱导T细胞产生应答，导致体内T细胞持久性和活性受限;共刺激信号是最佳的T细胞功能，代谢和持久性所必需的。共刺激域可产生IL-2，并可在重复抗原暴露后增殖。研究最广泛的共刺激域来自于CD28或4-1BB (CD137)，利用这些域的CAR-T细胞产品是FDA批准的。含有不同共刺激域的CAR-T细胞已在临床前模型中证实有效，但尚未在患者身上进行测试。基于CAR-T的四个模块组件，结合临床研究中CAR-T细胞的成功和失败案例，研究人员正以多种方式创新地设计CAR-T细胞。这些策略的目的是提高CAR-T细胞治疗的安全性和有效性，拓宽适合这种治疗的癌症范围，并促进这些药物更快速、可靠和有效的生产。目前FDA批准的CAR-T细胞产品，以及迄今为止用于临床试验的大多数产品，都是使用从预定的接受者身上获得的自体T细胞生产的。以这种方式产生的CAR-T细胞限制了受益患者的数量。原因有：首先，从癌症患者身上获取足够数量的T细胞是很困难的。第二，自体CAR-T细胞产品有一个冗长和个性化的制造过程，这对于晚期癌症患者可能不可行，因为在制造过程中疾病可能会恶化。最后，CAR-T细胞生产的失败也可以归因于单采样品的特性。例如，疾病相关的T细胞功能障碍，可能导致生产不成功或劣质产品，从而导致患者的不良反应。由同种异体的供体T细胞改造的CAR-T细胞提供了一种替代自体CAR-T细胞的方法，可以避免细胞数量不足、T细胞状态不佳和治疗延迟等制造问题。在血液系统恶性肿瘤的患者中，通常采用HSCT（造血干细胞移植），而CAR-T细胞是由人类白细胞抗原(HLA)匹配的同种异体造血干细胞供体产生的。部分HLA匹配供体的病毒抗原特异性T细胞是CAR转导异体T细胞的第二个潜在来源。移植的异体供体T细胞可以对受体的细胞产生反应，从而产生GVHD。相反，宿主的免疫细胞也能识别并消灭供体的T细胞。研究人员在探索各种各样的工程解决方案，以应对T细胞异体反应所带来的挑战，他们的目标是制造通用的、现成的异体CAR-T细胞。一种设计这种通用的CAR-T细胞的方法是使用基因组编辑技术来消除异体供体T细胞中αβTCR和/或MHC I类(MHC I)复合物的表达。由于αβTCR异源二聚体对整个TCR复合物的组装和活性是必需的，因此敲除TCRα链或β链的表达会阻止供体CAR-T细胞识别宿主的同种抗原，从而阻止GVHD。迄今为止，通过靶向破坏TRAC位点来删除α链是最常见的GVHD规避策略。在供体T细胞中编辑删除MHC I相反地会阻止这些细胞被受体的T细胞识别。锌指核酸酶(ZFN)是一种人工限制性内切酶，可以在基因组中确定的位置引起双链DNA断裂。这些断裂随后通过非同源端连接或同源重组DNA修复途径进行修复，可以利用这些修复途径破坏并阻止靶基因的表达。转录激活因子样(TAL)效应核酸酶(TALEN)技术也被用于敲除TCR。融合蛋白包括一个与TAL重复DNA识别域(称为megaTAL)结合的巨核酸酶，也被用来破坏αβTCR。然而这些基因编辑方法需要设计特定的核酸酶对，这限制了这些系统的广泛应用。CRISPR-Cas9平台已被用于阻止CAR-T细胞中TCR α链的表达或阻止TCR α链和β链、β2M和PD-1的组合。除了基因组编辑技术，替代的基因工程方法已被用于消除CAR-T细胞中TCR的表达，包括蛋白表达阻断剂(PEBL)系统。重要的是，这些技术都不能在CAR-T细胞中100%的敲除TCR，因此需要在患者使用之前进一步纯化T细胞产品。此外，敲除MHC I分子可能导致NK细胞介导的杀伤，可能不会阻止MHC II分子介导的CAR-T细胞排斥反应，MHC II分子在活化的T细胞中表达。第二种工程来生产CAR-T细胞的方法是在体外从不匹配的异基因造血祖细胞中产生它们，这些祖细胞随后将在宿主中发展成有功能的成熟CAR-T细胞。这种方法确保了注入的CAR-T细胞的MHC限制是由宿主MHC分子决定的，从而降低了移植物抗宿主病的风险。表达CAR的T细胞前体的临床前研究已经证实这些T细胞在体内成熟，但没有观察到GVHD。这种策略已经产生了一个良好的、可扩展的细胞产品，该产品来源于单一来源，没有原生TCR，并且在TRAC内源性调控元件的转录控制下表达CAR。通过上述方法消除产生自体CAR-T细胞产品的需求可能会避免治疗延误。此外，通用CAR-T细胞的发展将会改善该产品的生产和储存。这些生产上的改进可能会扩大癌症患者使用CAR-T细胞治疗的机会，也可能会降低CAR-T细胞治疗的实质性成本。经过基因工程改造以表达嵌合抗原受体（CARs）的T细胞已被证明对某些B细胞白血病或淋巴瘤亚型的患者具有治疗作用，并且令人印象深刻，在多发性骨髓瘤患者中也显示出了令人鼓舞的疗效。然而，在这些患者以及患有其他癌症，特别是实体瘤的患者中，各种障碍限制了功效，阻止了CAR-T细胞疗法的广泛使用。与CAR-T细胞有关的主要挑战包括严重的毒性，限制的运输，肿瘤的浸润和激活，体内次优的持久性，抗原逃逸和异质性以及制造问题。为了克服这些局限性并将CAR-T细胞的用途扩大到更广泛的恶性肿瘤，有必要使CAR设计超越常规结构而发展。为了提高这种治疗方式的安全性，有效性和适用性，研究人员正在通过广泛的工程策略解决当前的障碍。主要的CAR-T细胞毒性可分为两类：①与T细胞活化有关的一般毒性，以及随后系统释放高水平细胞因子的毒性；②由非恶性细胞表达的CAR与其靶抗原之间的特异性相互作用产生的毒性，称为靶向非肿瘤效应毒性。在许多临床试验中已观察到用CAR-T细胞治疗的患者体内，细胞因子水平的严重升高，甚至致命。这些作用反映了CAR-T细胞与癌细胞或宿主免疫系统细胞的强大相互作用，导致免疫细胞交叉活化，系统性细胞因子的恶性释放可能达到有毒水平。这些毒性包括细胞因子释放综合征（CRS），噬血细胞淋巴组织细胞增多症（HLH）/巨噬细胞活化综合征（MAS），以及免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS）。为了达到临床疗效，同时避免全身细胞因子毒性，CAR-T细胞必须达到激活和细胞因子分泌的阈值水平，而不超过导致细胞因子释放恶性循环的水平。CAR-T细胞激活的程度和激活动力学受肿瘤总负荷、肿瘤细胞抗原表达水平、抗原结合域对靶表位的亲和力以及CAR中包含的共刺激结构域等影响。因此，在优化治疗效果和限制毒性方面，仔细考虑CAR的模块化结构的几个组成部分是必要的。共刺激结构域的选择是一个可修改的CAR设计变量，可以根据肿瘤类型和负荷、靶抗原和抗原密度以及使用的scFv进行调整。对于高疾病负担和高抗原密度肿瘤患者，4-1BB结构域毒性较小， T细胞耐久性较高, T细胞增殖峰值也较低。在总表面抗原密度较低和/或具有低亲和力抗原结合域的情况下，可能需要CD28结构域来达到所需的T细胞活化阈值，可使CAR-T细胞活性的起始和随后的衰竭更为迅速。通过修饰活化的CAR-T细胞的铰链区和跨膜区也能调节细胞因子分泌。例如，对靶向CD19的CAR中，CD8α衍生铰链和跨膜氨基酸序列的修饰导致CAR-T细胞增殖减少和细胞因子释放水平降低，且在I期试验中，实验数据良好，未观察到分级>1的ICANS或CRS。宿主免疫细胞对CAR结构的识别以及随后的免疫反应也可能导致细胞因子相关毒性。因此，将人类或人源化抗体片段代替小鼠抗体的片段用于CAR构建，以及细胞外铰链区和/或跨膜结构域的修饰均可降低CAR的免疫原性。而且这种策略可能同时降低细胞因子介导毒性的风险，并改善CAR-T细胞的持续性。用CAR转导的T细胞通过基因工程进一步修饰，可避免或改善毒性。在临床前模型中，使用抗体lenzilumab抑制巨噬细胞和单核细胞激活细胞因子GM-CSF后，CRS的风险降低， CAR-T细胞活性增加，转基因T细胞中GM-CSF的突变失活也具有类似的效果。此外，髓系细胞特异性酪氨酸羟化酶的缺失或使用甲状腺素抑制该酶，可降低儿茶酚胺和细胞因子水平。或者，CARs可以被设计成识别双特异性的适配器分子，这些分子也包含与癌细胞上表达的受体（例如叶酸受体）结合的部分，从而桥接CAR T细胞和癌细胞（图2Aa）；这些短半衰期的剂量，然后可以动态控制小分子适配器，以防止或终止CRS。另一种控制CAR-T细胞毒性的策略是将“关闭开关”或“自杀基因”植入CAR结构中，当细胞因子介导或靶向发生非肿瘤毒性时，提供一种使CAR-T细胞失活的方法（图2Ab–d，2Ba,b）。目前这种方法的临床疗效仍有待确定。它的一个局限性是抗体介导的杀伤CAR T细胞的起效缓慢，这可能会限制其在严重的急性细胞因子介导的毒性时需要快速逆转的患者中的疗效。这促使人们开发出更快的开关，如诱导性Casp9。在一项临床试验中，诱导性Casp9在30分钟内消除了90%以上经过基因改造的T细胞。动态和快速控制CAR-T细胞功能的另一种策略是基于蛋白酶的小分子辅助关闭CAR（SMASh-CAR），也称为关闭CAR（SWIFF-CARs）（图2Ad）,来调节T细胞表面CARs的表达。在该系统中，蛋白酶靶位点和蛋白酶与“degron”部分一起嵌入CAR构建体中，该“ degron”部分促进CAR蛋白的降解。在“开”状态下，靶位点被切割，导致从CAR蛋白上去除了degron，因此CAR在T细胞的表面表达。然而，在使用外源性小分子蛋白酶抑制剂时，CAR蛋白没有被切割，从而导致degron保留并通过蛋白水解途径使CAR降解。这种毒性的机制尚不明确，但旨在限制靶向肿瘤外毒性的技术仍可提供更有效的CAR疗法。相对于非恶性细胞优化CARs与癌细胞的相互作用（图3Aa-d），这些策略是基于对肿瘤更特异的抗原的靶向性，引入对多种抗原的需求或缺乏特定抗原（逻辑门控CARs）（图3Ba）和/或限制CAR的空间和时间活动（图3Bb）。依赖于肿瘤和非恶性组织之间抗原表达水平的差异可避免对同样表达靶抗原的非恶性组织的毒性作用。在肿瘤细胞上比在非恶性细胞上表达更高水平的抗原可以使用低亲和力的scFv CARs作为靶点，从而确保只有具有高抗原密度的肿瘤细胞能够提供足够高的亲和力来激活CAR-T细胞。临床试验说明scFv的细微变化可能对CAR-T细胞的治疗窗口产生深远影响。为提高CAR-T细胞对肿瘤细胞的特异性，通过将CD3ζ和共刺激结构域连接到单独的受体，每个受体识别不同的抗原可以实现逻辑门控效应（图3）。还有一个相关的策略是基于抑制性CARs的使用，抑制性CAR被设计成在与非恶性细胞（而不是肿瘤细胞）表达的抗原结合时抑制T细胞的激活，从而确保只有在肿瘤中才能通过共表达的活化CAR发出生产性信号（图3Ab）。此外，降低传统CAR T细胞固有毒性潜能的另一种方法是将CARs引入具有更有利抗肿瘤和安全性的T细胞亚群（图3Ac）。目前，CAR-T细胞在某些血液系统恶性肿瘤患者中的疗效是最明显的，主要是CD19+大B细胞淋巴瘤或ALL。虽然抗原逃逸和CAR-T细胞在体内有限的持久性限制了CAR-T细胞治疗，但是已经有许多工程化策略被用来解决这些障碍，并扩大CAR-T细胞在CD19-血液系统恶性肿瘤中的使用。在接受CAR-T细胞治疗的患者中，在相当一部分患者中观察到了抗原逃逸，即癌细胞完全或部分丧失靶抗原的表达。例如，来自多个试验和机构研究的报告表明，以CD19为靶点的CAR-T细胞治疗的患者中有7%-25%的患者复发了CD19-疾病。研究人员目前正试图通过一系列靶向多种抗原的组合策略来解决抗原逃逸的问题(图4A)。使用靶向不同抗原的不同CAR-T细胞产品进行序贯治疗已经被证明在临床上是有用的。多靶点CAR-T细胞疗法可以通过在输注前混合不同的靶向单一抗原的CAR-T细胞产品或通过转导具有多个CAR结构的T细胞来实现。或者，可以通过设计具有两个(或更多)不同结合域的单个CAR分子工程化得到双特异性CAR-T细胞，并且CD19/CD20或CD19/CD22双特异性CAR-T细胞已经在B细胞恶性肿瘤患者中证明了其临床疗效(图4Aa)。另一种多靶点的策略通过进一步修饰CAR-T细胞来分泌BiTEs(双特异性T细胞结合蛋白，图4Ab)。BiTEs通常由两个单链抗体组成，一个针对CD3，另一个针对TAA，通过连接子连接，因此可以在物理上将T细胞与癌细胞联系起来。研究人员已经证明，在白血病和实体瘤的临床前模型中，分泌BiTEs的CAR-T细胞在克服抗原表达的异质性和绕过抗原逃逸方面是有效的。创造能够引发内源性免疫反应的CAR-T细胞是产生针对多种TAA的T细胞反应的另一种方法。这种CAR-T细胞被称为armoured CAR-T细胞，与免疫调节剂共同修饰，其中这些免疫调节剂参与并调节宿主免疫系统的其它细胞。例如，CAR-T细胞被修饰为表达促炎分子CD40L(图4Dc)，CD40L共刺激能增强固有功能，这些细胞还能够激活专业的抗原提呈细胞，并通过与CD40的结合来提高肿瘤细胞的免疫原性，从而促进内源性未修饰T细胞对肿瘤细胞的识别和消除。另一个修饰CAR-T细胞的例子是分泌HVEM (可溶性疱疹病毒进入介质，也称为TNFRSF14)，它能与B细胞淋巴瘤细胞上的抑制性受体BTLA (B淋巴细胞和T淋巴细胞衰减器)结合，从而导致肿瘤抑制。增强CAR-T细胞在患者体内持久性的一个很有前景的策略是使用具有较高比例的分化程度较低的T细胞亚群。这些T细胞亚群包括初始T细胞，TSCM(干细胞记忆T细胞)和TCM(中央记忆细胞)，具有较强的增殖能力(图4Ba)。临床前研究表明，与传统的CAR-T细胞产品相比，从预选的初始T细胞群中产生的CAR-T细胞或在激酶抑制剂存在下产生的CAR-T细胞，是分化程度较低的CAR-T细胞，它们的植入、增殖和抗肿瘤活性都优于传统的CAR-T细胞产品。此外，以1:1的CD4+与CD8+T细胞比例向患者输注CAR-T细胞已被证明会导致细胞剂量相关的CAR-T细胞扩张增加和毒性降低。共刺激信号是CAR-T细胞有效功能的重要组成部分，但过度的共刺激信号可能会降低CAR-T细胞在患者体内的持久性。因此一些工程化策略正在开发已解决这个问题，包括改变CAR的共刺激结构域以降低信号的强度，例如在CD28结构域内突变一些基于免疫受体酪氨酸的激活基序。共刺激信号的调控也可以通过共表达CAR-T细胞的自体刺激和反式刺激的配体来实现。例如，有研究证明了与仅表达基于CD28或4-1BB的CAR-T细胞相比，在CAR-T细胞上共表达4-1BBL与CD28共刺激结构域可使得armoured CAR T细胞具有更好的持久性、衰竭标志物的表达减少以及较高的CD8+/CD4+T细胞比率(图4Bb)。
与CAR-T细胞在治疗血液系统恶性肿瘤患者方面取得的显著成功形成鲜明对比的是，迄今还没有在实体瘤患者身上证明CAR-T细胞显著的疗效。CAR-T细胞在实体瘤患者中未能达到期望的疗效，可能归因于几个因素：缺乏合适的肿瘤特异性抗原，或者缺乏具有可能与可耐受的靶点上、肿瘤外毒性相关的表达谱的TAA。这种普遍存在的障碍可以通过额外的CAR-T细胞工程来克服，而实体瘤的复杂结构和细胞环境影响着肿瘤生物学和治疗反应，实体肿瘤间质的结构可能会对CAR-T细胞的渗透构成物理障碍，另外TME中存在的抑制性免疫细胞也可能抑制固有的抗肿瘤免疫反应以及CAR-T细胞反应。已经开发了许多策略来克服实体肿瘤的抗原异质性，其中一些策略反映了前述在血液系统恶性肿瘤中克服抗原逃逸的策略。例如，抗EGFR BiTEs已被证明在小鼠胶质母细胞瘤模型中增加了抗EGFRvIII CAR-T细胞的有效性，在卵巢癌、结肠癌或胰腺癌的临床前模型中也增加了抗叶酸受体-α CAR-T细胞的有效性。已经开发了几种技术来创建通用CARs，其衔接子元件被用作配体，从而能够利用单个CAR-T细胞群靶向多个抗原(图4Ac)。例如，连接亲和素的CARs (称为生物素结合免疫受体)与生物素标记的抗体相结合，不仅可以用来控制CAR-T细胞的活动，类似于安全开关，而且还可以按顺序或同时靶向多个抗原。这些技术可能提供一种成功靶向患者异质实体肿瘤的方法，同时将肿瘤外毒性降至最低。局部输注CAR-T细胞也可能限制靶上和肿瘤外的毒性，有研究说明了使用局部传递来启动全身抗肿瘤免疫反应的可能性。然而许多转移性实体肿瘤不适合局部治疗，因此正在努力设计具有内在能力的CAR-T细胞，以运输到疾病部位。许多趋化因子介导免疫细胞的贩运，趋化因子信号的调节已被探索以增强T细胞对肿瘤的定位(图4Ca)。例如，在一项临床前研究中， CSF-1R在CAR-T细胞中的表达使这些细胞对CSF-1(一种在许多实体肿瘤中富含的单核细胞募集趋化因子)产生反应，增强了CAR信号的增殖效果，且不会影响细胞毒性，也不会诱导向髓系的转分化。已经探索了几种方法来增强CAR-T细胞穿透物理屏障进入实体癌的TME并通过抑制性间质结构的能力(图4Cb)。FAP (蛋白酶成纤维细胞激活蛋白)由许多肿瘤相关间质成纤维细胞表达，并在ECM (肿瘤细胞外基质)的重塑中发挥作用，使这种脯氨酰内肽酶成为增加免疫细胞向肿瘤渗透的有吸引力的靶点。用CAR-T细胞靶向表达FAP的基质细胞的研究取得了好坏参半的结果。在一项研究中，靶向FAP的CAR- T细胞通过影响骨髓中的FAP+基质细胞而导致恶病质和骨骼毒性，然而在另一项使用免疫活性小鼠模型的研究中，具有不同抗FAP单链抗体的靶向FAP的CAR-T细胞在与疫苗联合给药时减少了肿瘤生长，且没有严重毒性。因此，靶向FAP的CAR-T细胞的有效性和毒性需要进一步研究。工程化CAR-T细胞分泌ECM修饰酶是促进这些细胞渗透到实体瘤中的另一种方法。与缺乏肝素酶的CAR-T细胞相比，通过表达肝素酶来降解ECM中的硫酸肝素蛋白多糖的抗GD2 CAR-T细胞具有更强的渗透小鼠异种移植瘤的能力，并延长了生存时间。其他ECM降解酶还在探索在CAR T细胞疗法中的作用，但是ECM修饰酶的复杂和不可预测的影响，还需对其持谨慎的态度。
除了定位于肿瘤，CAR-T细胞还需要克服在TME存在的直接T细胞抑制信号。虽然TME中可能存在多种抑制信号，但最具特征的通路涉及PD-1。PD-1是一种免疫检查点受体，在活化的T细胞上表达，当与PD-L1结合时，PD-L1可由肿瘤细胞和其他细胞类型表达，诱导T细胞采用耗竭、无效的表型，PD-1通路的抑制可使某些类型癌症患者获得显著的临床益处。PD-1和其他抑制性受体的表达已被证明是CAR-T细胞功能障碍的一个机制，许多研究已经证明，在临床前模型和ALL或弥漫性大B细胞淋巴瘤的患者中，CAR-T细胞治疗联合注射抑制PD-1通路的抗体一起提高了疗效。研究人员没有将CAR-T细胞与已建立的免疫检查点抑制剂结合使用，而是展示了成功的策略，通过基因工程将PD-1途径的破坏转化为CAR-T细胞本身(图4Da)。例如，与没有这种诱骗受体的CAR T细胞相比，转导了截短的显性负性PD-1受体的抗间充质蛋白CAR T细胞缺乏细胞内信号域，能够与PD-L1结合，但不能传递抑制信号，抵抗PD-L1诱导的衰竭并延长移植胸膜间皮瘤小鼠的存活时间。
作为克服TME中抑制信号的一种替代方法，CAR-T细胞可以被改造成提供免疫刺激信号，增强CAR-T细胞本身的活性，在某些情况下，还可以通过重塑实体瘤的微环境来诱导内源性抗肿瘤反应。无论靶向TAA的数量如何，抗原逃逸始终是CAR-T细胞治疗的一个问题，因此，可能需要招募内源性免疫细胞来传播抗肿瘤免疫反应。增强CAR-T细胞分泌刺激性细胞因子，不仅促进T细胞的增殖、持久性和抗肿瘤活性，而且改变实体瘤的免疫环境。事实上，人们已经探索了许多细胞因子来产生这种形式的armoured T细胞(图4Db)，也被称为TRUCKs(被重新定向用于通用细胞因子杀伤的T细胞)。IL-2在免疫应答中具有多方面的作用，包括激活T细胞和NK细胞。IL-15是T细胞和NK细胞分化、动态平衡和存活所必需的。IL-18是一种由巨噬细胞分泌的多功能细胞因子，这种细胞因子可以改变T细胞和NK细胞的表型，并已被证明能促进人效应性T细胞在小鼠体内的植入，并抑制免疫抑制的人Treg细胞在小鼠体内的植入。分泌这些细胞的CAR-T细胞在许多临床前试验被证明具有更好的抗肿瘤活性，但在临床试验中也观察到了毒性或致病作用，因此在临床上进行研究还需谨慎。还有许多其他细胞因子也在临床前模型中进行了探索，以增强CAR-T细胞功能。图5C.AR-T细胞的生命周期及其治疗安全性和有效性面临的相关挑战目前CAR的模块化设计使其能进行改进以应对TME带来的挑战。通过使用合成生物学和基因编辑技术，研究人员可以有效地设计CAR-T细胞，使其更加安全和有效(图5)。此外，CAR-T细胞还可以用作活的T细胞“微型药房”，将免疫调节分子定向输送到TME。与此同时，增加CAR设计的复杂性和T细胞的基因编辑可能会放大与CAR-T细胞治疗相关的风险，对体外细胞产品进行复杂的基因编辑也增加了制造过程的复杂性，新的工程化方法也可能会增加本已经很高的CAR-T细胞制造成本。总之，目前科学家们正在不断开发策略，以增加CAR-T细胞疗法的有效性和范围，同时提高安全性并促进这些药物的有效生产，有望使这项技术在抗癌治疗中得到更广泛的应用，并扩大CAR-T细胞为患者带来的好处。
https://doi.org/10.1038/s41571-019-0297-y