mRNA疫苗的生产和质控
mRNA疫苗是将外源靶抗原的基因序列通过转录、合成等工艺制备的mRNA通过特定的递送系统导入机体细胞，通过在体内表达目的蛋白，刺激机体产生特异性免疫学反应，从而使机体获得免疫保护的一种核酸制剂。
mRNA疫苗的生产
mRNA疫苗的生产依靠体外合成，其生产周期较短，易于规模化，可实现疫苗生产的快速工业化。从mRNA的体外转录（In Vitro Transcription，IVT）到mRNA- LNP复合体的制备，整个生产周期持续约10天，加上认证和发布所需的时间，产品最短可以在40天内上市。
其生产过程主要包括以下步骤：
-靶抗原序列设计；
-质粒构建；
-三级细菌种子库的构建；
-DNA模板制备；
-mRNA的体外转录；
-mRNA纯化；
-LNP包封；
-mRNA-LNP的稀释和浓缩；
-无菌过滤灌装
-其他步骤(可见下图)
始于靶抗原的合成，检索所需的基因序列，优化抗原基因序列并克隆到质粒后，扩增培养工程菌，使用限制性内切酶将质粒线性化，或在临床前研究或小规模生产中使用PCR扩增目标DNA以获得IVT的线性化DNA模板。以线性DNA作为模板，核苷三磷酸（nucleoside triphosphate，NTPs）作为T7、SP6或T3 RNA聚合酶所需的合成mRNA分子的前体，加上核糖核酸酶抑制剂、焦磷酸酶、聚合酶辅因子MgCl2，以及含有聚胺和抗氧化剂的pH缓冲液，经过几个小时的IVT后，每毫升转录反应可产生毫克级mRNA。mRNA IVT反应除目标mRNA产物外，还包括酶、NTPs、DNA、异常转录产物（如dsRNA和截短的RNA片段）等许多杂质。
通常使用DNase处理从获得的mRNA制备物中去除DNA，氯化锂沉淀用于进一步纯化mRNA，并采用高效液相色谱法、磁珠法、阴离子交换法或超滤法和透析法去除dsRNA和截短的RNA片段。
大多数先进的mRNA疫苗使用LNPs作为传递系统。将组成LNPs的四种脂质(可电离脂质、磷脂、胆固醇和PEG-脂质)溶于乙醇中，以已知浓度制备每种溶液，然后以不同的摩尔比混合，制备混合脂质相。之后在pH 4.0的缓冲溶液中稀释目标mRNA以制备水相。在适当的脂质/mRNA比例下，将脂质溶液与mRNA水相在微流控或t -连接通道中混合，得到脂质包裹的mRNA。
mRNA疫苗的质量控制
虽然mRNA疫苗是一项新技术，其生产规模相对简单，但在这一过程中所采用的大多数方法都是复杂的，因此mRNA疫苗生产的质量控制仍然是一个挑战。
LNP-mRNA疫苗的质量控制涉及到靶基因序列、原料、mRNA纯度和完整性、mRNA/脂质比。COVID-19 mRNA疫苗的质量控制重点是原材料（质粒、菌种库、脂类、核苷酸和生产过程中使用的酶）、半成品和最终产品。
生产过程必须严格控制质粒中目的基因序列不被修改，此外质粒的纯度、超螺旋结构的比例、提取后的残留物质等生物学特性也应考虑在内。除了菌株质量控制外，还需确保转化所用的细菌确实是大肠杆菌，质粒基因序列、保留率、拷贝数和菌株纯度也是需要考虑的参数。脂类辅料的控制除了其来源、物理和化学特征（如外观、类型、纯度和残留溶剂）外，还应进行药物评价，以确保新的脂类辅料符合适用的法规。
此外，任何动物（包括人类）来源的起始原料或原料应提交控制，以确定来源、质控和风险评估，并应符合世卫组织关于生物和制药产品的可传播海绵状脑病的指南。同时，还必须考虑mRNA原液的鉴定、纯度和含量。mRNA原液中的工艺杂质包括残留DNA、RNA聚合酶、限制性内切酶、DNA连接酶、游离的核苷酸、mRNA帽子、dsRNA和错误折叠的RNA。
正确的mRNA加帽在mRNA转录和翻译效率以及减少炎症反应方面发挥着关键作用。因此，测定mRNA加帽率mRNA疫苗的质量控制至关重要，通常采用液相色谱-质谱法(LC-MS)进行测定。mRNA- LNP中间产物必须通过测量平均粒径、粒径分布、mRNA含量、包封率和无菌特性。总的来说，内部质量控制和发布标准的制定是至关重要的。
mRNA很容易被普遍存在的RNase降解，因此建议超低温保存以限制RNase的活性，同时有效地保证mRNA的稳定性。此外，超低温保存更有利于维持mRNA-LNP复合体的原始构象，采用冷冻干燥保存mRNA疫苗被证明可以有效地减少储存条件的要求，因此被认为是一种有希望提高mRNA疫苗稳定性的技术。
mRNA疫苗作为一种平台型技术，相较于传统疫苗有很多优势，在设计和构建上具有快速性、应变性以及全合成制备等优势，随着Moderna和BioNtech公司的新冠mRNA疫苗在临床上的大规模使用，其良好保护效力和的安全性得到进一步验证。
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1. 新型冠状病毒预防用疫苗研发技术指导原则（试行），药品审评中心，2020.08.
2. COVID-19 mRNA vaccines https://doi.org/10.1016/j.jgg.2021.02.006
3. Fang E.et al. Advances in COVID-19 mRNA vaccine development. Signal Transduct Target Ther. 2022 Mar 23;7(1):94. doi: 10.1038/s41392-022-00950-y. PMID: 35322018; PMCID: PMC8940982.
4. Aldosari B N.et al. Lipid Nanoparticles as Delivery Systems for RNA-Based Vaccines. Pharmaceutics. 2021 Feb 2;13 (2):206. doi: 10.3390/pharmaceutics13020206. PMID: 33540942; PMCID: PMC7913163.nnn
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