行研报告 | 生物制药上游专题: 病毒载体构建原料

 目录

  一、CGT病毒载体介绍及应用  二、主要生产方法和工艺壁垒  三、市场容量分析  四、上下游产业链分析  五、总结与展望

一

CGT病毒载体介绍及应用

基因疗法是借助载体将外源基因导入宿主细胞内进行基因修饰的一种治疗方法，在传染病，遗传性疾病和癌症等疾病治疗中具有巨大潜力。载体作为基因疗法的关键，主要分为病毒载体和非病毒载体两大类。目前非病毒载体包括质粒或裸露DNA、LNP递送系统等，但体内转染效果差以及毒性过大严重制约了非病毒载体的临床转化。病毒载体主要有腺相关病毒、腺病毒、慢病毒、逆转录病毒、痘苗病毒、麻疹病毒、单纯疱疹病毒、甲病毒、水泡性口炎病毒、流感病毒。优质的病毒载体应具备有足够的、空间来递送大片段的治疗基因；具有高转导效率，能感染分裂和非分裂的细胞；能靶向特定的细胞，且可以长期稳定表达转基因；具有较低 的免疫原性的或致病性，不会引起炎症；具备大规模生产的能力等优点。目前临床上用于体内基因治疗的主要病毒载体有腺病毒，腺相关病毒和慢病毒。

1.1 腺病毒

腺病毒（AD）是一类DNA病毒，基因组大小为34-43kb，包裹在无包膜的二十面体病毒颗粒中，是临床上最早用于体内基因治疗的病毒载体之一。Ad载体的显著特点包括：(1)多个基因组拷贝可以被传递到一个宿主细胞中，从而导致高水平的基因表达；(2)Ad载体的基因表达是暂时的，并且不整合到宿主基因组中；(3)可以转导分裂和非分裂细胞；（4）具有很强的免疫原性。

腺病毒载体的发展可分为三代：第一代腺病毒载体能避免病毒DNA的复制和病毒衣壳蛋白的产生，避免其基因组整合到宿主细胞中，但该类载体未经纯化时可引发较强的免疫反应，抑制外源基因表达。第二代腺病毒载体的安全性更高，但由于其表达的病毒效价过低，表达持续时间太短，且缺少相应细胞系，该类腺病毒载体应用较少。第三代腺病毒载体缺失了所有病毒蛋白编码序列，只保留了包装信号和复制元件，外源基因插入量可达36 kb,安全性大大提高。但其在病毒包装过程中需要辅助腺病毒和互补细胞系，导致其难以分离纯化和规模化生产，局限性较大。目前，腺病毒载体主要集中在疫苗接种和溶瘤治疗，也正被测试用于疟疾，炭疽，HIV，流感，乙型肝炎和丙型肝炎，以及严重血友病以及心血管和更多疾病的临床试验。

1.2 腺相关病毒

腺相关病毒(AAV)是目前应用最广泛的体内基因治疗病毒载体。AAV是一种非致病性的病毒，基因组长4.7kb，包裹在一个无包膜的二十面体衣壳内。AAV载体的主要特征包括：(1)可以转导分裂和非分裂细胞，并且不将自身DNA整合到宿主基因组中；(2)能够长期稳定地表达基因；(3)具有低免疫原性。由于这些特性，AAV是最适合体内基因治疗的病毒载体，特别是在需要长期基因修改的情况下。目前AAV载体已被用于200多项临床试验来治疗多种疾病，包括A/B型血友病、先天性黑蒙症、遗传性脉络膜视网膜营养不良、全色盲和Leber的遗传性视神经病变。此外，还有许多临床试验正在测试用AAV来治疗溶酶体贮积症、阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症、癫痫、1型脊髓性肌萎缩、异染性脑白质营养不良、芳香族L-氨基酸脱羧酶缺乏症，以及巴特病等。

1.3 逆转录病毒

逆转录病毒（RV）是一种有包膜的球形病毒，以RNA的形式携带其遗传物质。逆转录病毒载体可以将其遗传物质(单链RNA)反向转录成双链DNA，并整合到宿主细胞的基因组中。用于基因治疗的逆转录病毒载体的主要优点是它们可以携带一个大的目的基因(9-12kb)，并由于它们整合到宿主基因组中而导致基因的长期表达。然而，逆转录病毒载体需要细胞分裂才能将其DNA整合到宿主基因组中，因此它们只能转导分裂中的细胞。此外，逆转录病毒载体有将其DNA随机插入宿主染色体并导致插入突变的风险。已开发出缺失长末端重复序列启动子或增强子的自失活载体，以降低插入突变的风险。迄今为止RV载体已进行了500多项基因治疗的临床试验，如癌症，地中海贫血，HIV，ADA-SCID，黑素瘤，WAS等。

1.4 慢病毒

慢病毒（LV）是一种重要的基因治疗病毒载体，主要应用于体外基因治疗，而目前也在临床上进行体内基因治疗的研究。慢病毒是逆转录病毒的一个亚型，以RNA的形式携带遗传物质。慢病毒可以将其基因组整合到非分裂细胞中并进行转导。第一代慢病毒载体最初来自人类免疫缺陷病毒1（HIV-1），新一代慢病毒载体来自非人类慢病毒。慢病毒载体的特征包括：(1)能够转导分裂和非分裂细胞，(2)能够长期表达基因(3)与逆转录病毒载体相比，降低了遗传毒性和插入突变的风险。慢病毒载体用于体内基因治疗的主要应用是治疗单基因疾病和慢性疾病，包括神经系统疾病、眼科疾病和代谢性疾病。

图1-1四种病毒载体比

数据来源：公开资料
病毒载体的制备是一个复杂的过程，需要将带有编码病毒和目的基因的质粒转入工具细胞，从而生成带有目的基因的病毒载体，再通过提取、纯化、过滤得到所需的病毒载体。

二

主要生产方法和工艺壁垒

2.1 关键原材料

载体生产通常需要的关键原材料是细胞、培养基、血清、质粒。病毒载体的生产较常用是HEK293，HeLa和HT1080细胞系。HEK293细胞系是通过用剪切的腺病毒5型DNA转化人类胚胎肾细胞而建立的，从1973年开始从人体里面分离出来之后逐步形成了许多亚型和衍生物，如HEK293-T、HEK293-F、HEK293-E、HEK293-6E。HEK293-T通过表达温度敏感的SV40 T抗原突变体而建立。T抗原的表达允许携带SV40复制起源的质粒在转染到细胞中时复制。HEK293-F细胞是GIBCO®品牌细胞，从HEK293克隆而来，适用于无血清培养基中的悬浮培养。‎HEK293-E是通过表达EBNA-1建立的，其允许质粒与oriP的表观体复制。HEK293-6E细胞系是通过表达截断EBNA-1建立的，缺乏Gly-Gly-Ala结构域。与HEK293-E相比，HEK293-6E显示出改善的瞬时基因表达和细胞生长。HEK293、HeLa和HT1080细胞通常具有良好的转染效率，也能产生高滴度的载体，是目前使用最广泛的人类细胞系。出人源细胞外，一些动物细胞在病毒载体生产中的作用也已经被验证，如Sf9昆虫细胞可用于1000-L或更大规模的腺相关病毒生产，而且成本效益明显，但生产步骤较为复杂，不利于成本控制。 

培养基也是载体生产中的主要原料之一，根据有无血清分有血清培养基和无血清培养基。由于血清会增加污染风险，所以大规模生产更青睐于无血清培养基，但培养效果和有血清培养基相差较大。对于血清的使用尤以胎牛血清使用最为广泛。目前，慢病毒载体的生产主要采用第三代质粒包装系统。第二代包装系统虽然目前尚未见产生可复制性病毒的报道，但从重组概率和元件设计上考虑，第三代包装系统均更为安全。逆转录病毒稳定产毒细胞株的构建常采用三质粒系统。

2.2 转染方式

病毒在细胞内生成主要由两种方式，分别是瞬时转染与稳定细胞系表达。前者使用灵活开发时间短，后者可以降低病毒生产成本。

（1）瞬时转染法：将含目标基因的病毒质粒和多个用于辅助病毒生成的质粒（包括病毒外膜蛋白基因等）同时递送给工具细胞，由工具细胞生产病毒载体。常见的三质粒系统包括包装质粒、包膜蛋白质粒和包含目标基因的质粒，共同进入细胞后表达组装行成病毒。（2）稳定细胞系表达法：将目标基因及病毒包装基因插入生产细胞系（如 293T 细胞），构建可以稳定表达生产目标病毒的细胞系。通过筛选和测试挑选最优克隆系，进行放大并高密度悬浮培养。一般来说，超螺旋质粒DNA转染效率较高，在转染后24-96小时内分析结果，常常用到一些报告系统如荧光蛋白，β半乳糖苷酶等来帮助检测。后者也称稳定转染，外源DNA既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体（episome）存在。尽管线性DNA比超螺旋DNA转入量低但整合率高。外源DNA整合到染色体中概率很小，大约1/104转染细胞能整合，通常需要通过一些选择性标记，如来氨丙基转移酶（APH；新霉素抗性基因），潮霉素B磷酸转移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。

2.3 转染试剂

除了转染方法的合理选择，符合GMP的转染试剂对病毒载体生产过程中转染环节的质量保障至关重要。阳离子聚合物 - 聚乙烯亚胺（PEI）是目前报道的工业化、大规模瞬时转染表达重组蛋白领域最广泛使用的转染试剂。这种聚阳离子能将各种报告基因转入各种种属细胞，其效果好于脂质聚酰胺，而且细胞毒性低。Polyplus-transfection SA公司提供的PEIpro® 系列产品中的PEIpro®-GMP是质量等级最高的PEI，且唯一配有MPC连接器和焊接管的袋装转染试剂，非常适用于GMP要求的封闭系统生产制造临床级治疗性病毒载体。此外，Mirus公司推出新的病毒包装专用转染试剂TransIT-VirusGEN，在核酸结合、复合物形成、将DNA递送到细胞以及从核内体释放并同时表达2到4个不同质粒等方面表现非常优异，是用于基因和细胞治疗的高滴度病毒载体生产方面的一项重大突破，能帮助生物制药商能够大规模生产病毒载体。

2.4 质量评价

衡量载体制备质量主要考虑两个方面：满颗粒对空颗粒的水平和感染性帽状物对非感染性颗粒的水平。这些基本上决定了产品的效力和潜在的副作用水平，如效力的丧失或免疫反应。理论上，一个完美的载体制剂的总颗粒与感染性颗粒的比例为1。因此，在载体设计、细胞系或重组载体的生产方法方面有改进的空间。此外，一些因素会影响这些质量参数，如培养方法（摇床与生物反应器），通过转染与转导生产等。

2.5 生产工艺优化

对于病毒载体的生产工艺优化，首要步骤是要培育出高产量的细胞系，所以开发一种典型的、基于高产量筛选的细胞系筛选模式至关重要。其次要确保病毒控制，以防止污染，这需要对上游到下游所有的生产过程进行严格监管，以及确定是否使用血清以及使用半封闭还是全封闭培养模式。此外，转染也是一个关键环节，必须考虑使用的质粒比例、细胞密度、不同类型的培养基以及转染试剂来确保转染效率。

2.5.1 腺病毒载体

腺病毒载体生产时，如以批次模式进行，在高细胞浓度条件下，会观察到细胞密度效应。已经研究过不同的方法，以规避这个问题，例如在转染前后置换培养基以及通过补料分批优化批次结果。但灌流是克服腺病毒生产中细胞密度效应的最可行的策略。当补料分批和灌流培养的平均细胞特异性病毒产率相当时，灌流培养中检测到的平均病毒滴度远远超过补料分批培养。

2.5.2 腺相关病毒载体

腺相关病毒载体一般通过腺病毒辅助质粒、腺相关病毒辅助质粒和腺相关病毒载体质粒转染HEK293细胞来生产。当使用摇瓶和摇动生物反应器时，在悬浮中生长的HEK293细胞比贴壁的HEK293细胞产生更多的腺相关病毒载体，并且最常用于制造临床研究的腺相关病毒载体。腺相关病毒载体的大规模生产也已经使用稳定的HeLa细胞系-腺病毒方法、疱疹病毒辅助方法和基于腺相关病毒Bac的系统。

2.5.3 逆转录病毒

逆转录病毒载体的生产包括两个步骤：以质粒DNA形式构建载体，依靠逆转录病毒包装细胞系表达病毒复制所需的蛋白质，从而大规模生产病毒。当逆转录病毒自身携带可选择性标记时，可以用病毒直接转导细胞，如果无选择性标记，则需要借助具有选择性标记的质粒转染细胞，最后都是通过分离和筛选后，从滴定最高的克隆中获取病毒。PE501和PT67是常见的两个逆转录病毒包装细胞系。

2.5.4 慢病毒

对于慢病毒载体的大规模生产，既可以在小规模生产的基础上进行扩展，也可以通过采用悬浮培养系统实现。目前大多通过增加培养/生产单元来实现扩展，即采用大量的多层培养系统，其有开放和半封闭两种模式，后者对操作人员、环境及终产品的安全性更高。悬浮培养主要借助细胞可以在没有载体的情况下迅速悬浮生长的优势，使细胞大量扩增。此外，培养基中没有牛血清及其他动物来源的组分，从而可以降低被外源物质污染的风险。在悬浮培养模式下，细胞可以通过不同的容器进行扩大：摇瓶、玻璃生物反应器、不锈钢生物反应器、培养袋及一次性搅拌容器。

图 2-1 LV载体各项原料价格

资料来源：动脉网

三

市场容量分析

人工改造的病毒是目前基因治疗中最常用的载体。病毒载体优化升级则贯穿了整个基因治疗的发展史，感染效率更高、安全性更好的病毒载体的使用也是近年基因治疗取得成功的关键动因。根据ASGCT数据，89%在研CGT项目采用病毒载体作为递送系统，AAV和LV是最为常见的载体类型，分别常用于基因治疗和CAR-T等产品。

由于GCT产品的生产工艺门槛高，涉及到的技术难度大，相关法律法规严格，使得CGT产品相比传统制药更加依赖外包生产，其外包渗透率超过65%，远超传统生物制剂的35%。而考虑到作为核心的病毒载体的生产涉及十分复杂的工艺，难度极高，且制备周期较长，预期未来CGT的外包率仍将维持高位。根据药明康德投资者交流数据，预计2025年全球CGT 外包市场规模将达到101亿美元、国内市场达到17亿美元。

图3-1 全球病毒载体市场规模预测

资料来源：公开信息

3.1 腺相关病毒

AAV载体基因疗法针对不同疾病和治疗部位对应不同的使用剂量。除了血液和肌肉等常见部位的疾病外，若将AAV载体基因疗法的需求扩大到罕见病，全球已知的罕见病6000-8000种，合并后的总体人数约为2.5-4.5亿人。从需求端分析：假设各给药方式下罕见病和流行病每年接受治疗的患者人数分别为1000人和10万人，对应AAV载体年需求最高可达到1020量级。供给端分析：悬浮培养上游工艺的滴度为2×1013vg/L、贴壁培养滴度为4×1013vg/L， 下游工艺收率30%，年生产量20批；对应不同患者剂量，反应器每年供应的剂次差别较大，剂量为1×1015vg/人对应的年可供应剂次仅240 人，若要满足血友病、渐冻症等患者人数相对较多适应症的需求，预计产能缺口较大。

图3-2 在研AAV载体基因疗法主要适应患者数及剂量

数据来源：公开资料

 图3-3 不同疾病种类和给药方式对应载体需求量

数据来源：公开资料

3.2 慢病毒

考虑潜在适应症对病毒载体的总需求，根据文献测算LV载体总需求约为5×1013TU/年。假设上游滴度为行业平均水平1×107TU/ml，下游收率20%，若以每年20批计算，1个2000L悬浮生物反应器即可满足目前现有的需求，而 2000L悬浮生物反应器相对少见，目前普遍使用以固定床生物反应器为主，假设收率水平为5×1010TU/批，仍假设DSP收率为20%、每年生产20批，计算每年约需要250台的固定床生物反应器。长期来看若以假设的患者渗透率计算，LV未来产能大概率可满足商业化需求。

四

上下游产业链分析

病毒载体的工艺生产流程包括上游培养、下游纯化和制剂：从细胞库到细胞培养、共转染、病毒表达，病毒收获；下游的澄清、捕获、纯化；病毒载体的制剂、过滤、检测和放行。

上游分析：病毒载体细胞培养主要设备有单元式贴壁培养系统，固定床生物反应器和搅拌式生物反应器。转染主要有瞬时转染和稳定转染，瞬时转染将基因插入细胞中，而不需要将基因整合到到宿主细胞基因组中，具有灵活和高效的特性，可以减少开发时间。稳定转染涉及将基因整合到宿主细胞基因组上，所以前期花费时间较长。但稳转细胞系可以通过避免多质粒转染步骤简化病毒载体生产步骤，通过避免使用昂贵cGMP质粒降低成本，此外，稳转细胞系可以达到更高的细胞密度和病毒载体滴度，是相对理想的转染方法。细胞的扩大培养主要通过贴壁培养和悬浮培养两种方式，两者分别适用于贴壁细胞和非贴壁细胞的培养。贴壁细胞培养指细胞依附于固相表面进行培养生长，因此培养装置表面积大小限制了细胞扩增数量。贴壁培养常通过增加相同培养系统单元（烧瓶、滚瓶、立方体、HYPERStacks®）的数量（横向扩展）或使用连续更大的设备（纵向扩展）来实现生产规模化，但也会因此增加管理难度。与贴壁细胞相比，悬浮培养可以更方便地放大生产规模，并无需繁琐的细胞分离步骤。为了促进悬浮细胞的生长现已开发出各种容器培养系统，包括摇瓶、培养袋、搅拌槽生物反应器、玻璃生物反应器和不锈钢生物反应器

下游分析：捕获收集阶段是为了去除转染过程中的外加物质、血清蛋白和质粒DNA等污染物，以及宿主细胞来源的成分，如生产细胞、细胞碎片等。在初步捕获阶段 常采用低速离心及微滤，去除尺寸较大的杂质。在 GMP级别的浓缩通常采用超滤及切向流过滤两种方式进行病毒浓缩。下游工艺中最核心的步骤是层析纯化，直接关系到产品质量。该过程主要要考虑病毒的体积大，层析纯化过程中的可接触面积较小，影响和配基的结合和不同大小的杂质去除需选择不同层析方式两个难点。目前病毒生产的纯化首选色谱法，其具有高回收率、可扩展、一致性强等特点。纯化后的病毒载体为满足 GMP级的生产要求还需要对病毒载体进行表征和储存。通常需要在适当的缓冲液中进行浓缩和除菌过滤，并对滴度进行测定。最后，病毒载体按浓度要求完成制剂和灌装。

图4-1 病毒载体的生产流程数据来源：脉动网
图4-2 病毒载体下游生产工艺

数据来源：公开资料

五

总结与展望

基因疗法通过基因表达、沉默或者体外改造的手段来实现疗法升级或罕见病的治疗，克服传统小分子和抗体药物在蛋白质水平进行调控的局限性。随着基因编辑、载体改造等技术逐步成熟与相关产品上市，领域内投融资迅速升温，大量在研药物进入临床，根据ASGCT数据截至2021年10月已有1890项CGT在研项目，其中近30%处于临床阶段，适应症涵盖癌症（以CAR-T、TCR-T为主）、罕见病和AD、帕金森症（以基因疗法为主），预期2030年前后上市药物数有望超100个。

病毒载体是目前GCT的主要递送手段，主流包括腺相关病毒载体和慢病毒载体，其表达生产是CGT药物生产核心。病毒载体生产上游主要包括转染和培养，转染目前主流仍以多质粒共转染的瞬转工艺为主，培养上可采用贴壁或悬浮的方式。考虑到产能扩充，远期预计稳转悬浮培养将成为主流。下游步骤较生物药复杂，其收率通常仅15-30%。根据生产模型测算，预计AAV载体供需缺口将主要体现在商业化产品（部分适应症剂量大）；LV载体供应则可以满足商业化需求（患者数较少、剂量较小），大量在研CAR-T类项目或将影响企业产能的释放。

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