宾大团队再出手！LNP递送mRNA实现胎儿脑内基因编辑

撰文：Vergil

编辑：RNAScript

据报道，目前大约有7000到10000种先天性疾病与单基因突变有关，其中约有17%累及神经系统，包括神经发育迟缓、运动和认知功能障碍以及原发性神经元变性。许多遗传性中枢神经系统疾病常在胎儿未出生前就出现病理改变，发病后难以逆转。虽然临床上可借助产前护理和DNA测序技术在胎儿出生前进行诊断并通过蛋白质替代疗法干预，但目前临床实践中仍只能减轻症状或延缓病情进展。

随着基于mRNA的基因编辑工具发展，包括诺奖级技术CRISPR-Cas9和碱基编辑平台的发展，为单基因疾病提供了“一次性”治疗方案。虽然有多项概念验证实验已在静脉给药的小鼠模型中能有效靶向胎儿肝脏和心脏，但其递送系统多在靶向中枢神经系统上缺乏有效性。

以病毒载体为例，其应用通常会存在基因编辑工具尺寸的限制，特别是在胎儿个体中使用需要慎重考虑病毒免疫和载体整合风险。非病毒载体递送平台LNPs已在出生后小鼠和非人灵长类胎儿中获得验证。早前来自宾大研究团队的一篇研究论文“Ionizable lipid nanoparticles for in utero mRNA delivery”，就已在怀孕小鼠中验证了其筛选的LNP可安全实现子宫内递送mRNA，通过脐静脉注射成功递送mRNA至围产期小鼠胎儿肝脏，肺和肠道中，并实现较高的转染效率，但该研究还未验证其在中枢神经系统中的递送效率。

2023年7月17日，来自宾夕法尼亚大学的研究团队在ACS Nano上发表了题为“Ionizable Lipid Nanoparticles for Therapeutic Base Editing of Congenital Brain Disease”的研究论文。为实现在围产期胎儿（怀孕28周到产后一周时期）大脑中的高效递送以治疗先天性神经系统疾病，该团队首先在体内筛选了一个LNPs文库，并通过侧脑室注射(ICV)，根据在围产期及出生后小鼠胎儿中的转染效率和细胞向性优化了多个配方参数。此外，该团队还进一步在食蟹猴胎儿和人类脑脊髓液(CSF)中验证了其优化后LNP配方的转染效率。

LNP文库的合成与表征

在本研究中，研究者通过迈克尔加成化学合成法(Michael addition chemistry)，以三个不同长度的烷基尾C12(A), C14(B), C16(C)和标号为1-4的多胺核分子，制备了12个不同的可电离脂质（图1A），并与其他三组分胆固醇、DOPE和PEG脂质合成12个LNPs，其配方比例参考了该团队之前在成年小鼠中的一项配方[2]。最终合成的LNP通过尺寸、PDI、封装效率、pKa和zeta电位进行表征（表1）。

图1. 围产期胎儿脑内递送mRNA的LNP文库的设计与评价

表1. LNPs文库的尺寸、PDI、封装效率、pKa和zeta电位

LNP递送mRNA至围产期小鼠大脑

图1D展示了研究中评估LNP-mRNA递送至围产期小鼠大脑的方法，将LNP包封编码荧光蛋白酶的mRNA通过ICV注射到妊娠第18天（E18）BALB/c小鼠胎儿的侧脑室。该时期可模拟妊娠中期人类胎儿的神经发育阶段，也是治疗干预在技术上可行的时间点。ICV注射也是目前临床上安全有效递送治疗神经系统疾病药物的给药方法。

研究显示，LNPs相较于裸mRNA注射实现了更高效的mRNA转染（图1E）。其次，不同可电离脂质表现出的不同转染效率也体现了该成分在mRNA递送过程中的关键作用（图1F）。研究人员还发现，胎儿脑内的转染效率会随pKa的减少，尺寸大小的增加和zeta电位增加而上升。其中C3 LNP表现出比MC3 LNP高17倍的表达。体内分布分析结果显示，C3 LNPs相较于PBS对照组在心脏、肺、肠、肝、脾或肾中没有显著的表达，仅在大脑有强烈的荧光表达。

由于胎鼠ICV注射曾与宫内死亡率相关。考虑到出生后第0天（P0）ICV注射与良好的长期生存有关，且仍接近妊娠中晚期人类胎儿的中枢神经系统发育情况，研究人员还对新生第0天的小鼠也进行了对照试验，判断能否维持转染效果。新生儿脑内IVIS成像显示（图1F, G），C3 LNPs的转染效率也可以达到MC3 LNPs的8倍。

脑内分布研究显示，无论哪种LNP在大脑内均可观察到相似的全脑分布，仅在脑室、邻近星形胶质细胞和对大脑内部结构渗透有限的神经元中的表达，且并不具备向脑室周围间隙外的脑实质深处扩散的迹象。

图2. C3 LNP在新生儿小鼠脑内的细胞向性

LNP参数的进一步优化

研究人员针对前阶段实验表现最好的C3 LNP进行了参数上的进一步优化，包括配方摩尔比，N:P值以及编辑器mRNA共递送比例对递送转染效率的影响。

通过正交实验设计（DOE），研究人员在新建立的C3 LNPs文库中进行了筛选。研究显示，C3可电离脂质、DOPE、胆固醇和PEG以35:16:46.5:2.5摩尔比配制为最佳。

体外实验显示，N:P为20:1相比于N:P为10:1具有更好的脑神经母细胞递送效率，但毒性有所增强。进一步的实验中，IVIS成像显示，不同的N/P比值下配制的LNPs之间没有显著差异。因此考虑到体外实验的毒性，研究采用了N:P为10:1的比值

为实现将CRISPR碱基编辑mRNA和sgRNA递送到围产期胎儿脑细胞，mRNA和sgRNA的封装比例也会极大影响LNP的递送和转染。通过不同质量比的封装LNP在MPS-IH小鼠模型中进行了筛选。实验发现，封装的mRNA和sgRNA的比值为3:1时可获得最好的基因编辑水平。

图3. C3 LNP的体外参数优化

非人灵长类及人胎儿脑组织的验证

研究人员针对优化后的C3 LNP进行了非人灵长类胎儿模型（NHP）中的验证。该实验选择了0.61G的食蟹猴，胎龄接近妊娠中期人类胎儿的发育阶段。

通过免疫组化法检测胎儿脑内GFP的表达情况，侧脑室细胞中有很强的GFP表达，与小鼠模型中观察到的转染区域一致。这一结果表明，C3 LNPs在围产期胎儿大脑中的mRNA递送效率，可转化到更大的动物模型中。同时研究人员也强调，目前仍有进一步优化的空间。

在此基础上，研究人员进一步在体外人脑组织中进行了验证实验。通过患儿脑脊液离体培养，研究人员测试了C3 LNP的稳定性和转染情况。结果发现，C3 LNP的尺寸大小和多分散性均无显著变化（图4D），稳定性可维持一周（图4E）。

研究人员从两名接受神经外科手术的儿童患者的大脑皮层组织中获得并培养神经元进行了转染实验。实验显示，C3 GFP-LNPs的转染效率较高（图4F），且对这些细胞的活力没有显著影响（图4G）。封装胞嘧啶碱基编辑器（BE3）mRNA和sgRNA的LNP递送实验，证明了约有4%的目标基因获得了编辑（图4H）。

图4. C3 LNP子宫内递送mRNA到NHP胎儿大脑和在人类儿童脑脊液和大脑皮层组织细胞中的体外表现。

总结

将基于mRNA的治疗药物递送到围产期胎儿的大脑内，在目前有限的治疗选择下治疗先天性脑神经疾病具有巨大的潜力。然而，我们仍需要认真审视在孕妇，胎儿群体中使用的生物制品的安全性，在保障无严重不良反应和影响的情况下加深对药物及机制的了解。

我们曾报道了同样来自宾大的研究团队利用LNP-mRNA实现了针对造血干细胞体内原位基因编辑，治疗镰状细胞贫血等血液疾病的研究成果，同样也是对LNP-mRNA这一平台的应用探索。相信未来会有更多的应用场景等待我们的探索。

参考资料

[1] Palanki R, Bose SK, Dave A, White BM, Berkowitz C, Luks V, Yaqoob F, Han E, Swingle KL, Menon P, Hodgson E, Biswas A, Billingsley MM, Li L, Yiping F, Carpenter M, Trokhan A, Yeo J, Johana N, Wan TY, Alameh MG, Bennett FC, Storm PB, Jain R, Chan J, Weissman D, Mitchell MJ, Peranteau WH. Ionizable Lipid Nanoparticles for Therapeutic Base Editing of Congenital Brain Disease. ACS Nano. 2023 Jul 17. doi: 10.1021/acsnano.3c02268.

[2] Oberli MA, Reichmuth AM, Dorkin JR, Mitchell MJ, Fenton OS, Jaklenec A, Anderson DG, Langer R, Blankschtein D. Lipid Nanoparticle Assisted mRNA Delivery for Potent Cancer Immunotherapy. Nano Lett. 2017 Mar 8;17(3):1326-1335. doi: 10.1021/acs.nanolett.6b03329.

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