CAR-T细胞治疗后真实患者体内的免疫重建过程

前言

基于T细胞嵌合抗原受体（CAR-T）的过继细胞免疫疗法在血液肿瘤中取得了巨大成功，特别是B系血液肿瘤。虽然CD7 CAR-T治疗对复发/难治性(R/R)T细胞急性淋巴细胞白血病/淋巴瘤(T-ALL/LBL)有很强的抗肿瘤活性，但CAR-T治疗后的免疫重建仍不清楚。今天给大家分享一篇今年4月14日发表在Clinical Cancer Research(IF=11.5)期刊上的文章，本研究将临床试验与高通量单细胞转录组测序相结合，揭示接受CD7 CAR-T细胞治疗真实患者的免疫稳态细胞水平动态变化，真实反映免疫细胞治疗后患者体内免疫重建过程。

一、临床试验设计

一项非盲I期临床试验(ChiCTR2200058969)启动以评估供者来源的CD7 CAR-T细胞在7例R/R T-ALL/LBL患者中的治疗安全性和有效性。基于流式细胞术（FCM，flow cytometry）和PCR动态监测患者治疗后体内CAR-T细胞含量，细胞因子水平通过细胞术微珠阵列（CBA FCM，cytometry bead arrays）进行定量，采用单细胞RNA测序技术(scRNA-seq)分析免疫重建情况。

T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）和T细胞淋巴母细胞淋巴瘤(T-LBL)被视为同一种疾病，只是骨髓浸润程度不同。尽管采用强化多药细胞毒性化疗方案，但只有不到40%的成人和不到70%的儿童患者能达到5年生存率，对于R/R T-ALL/LBL，异基因造血干细胞移植（Allo-HSCT）是唯一的治疗选择，但也有25%的患者出现复发。CD7 在 T-ALL 细胞表面持续表达，其表达水平高于正常 T 细胞，使其成为可行的 CAR-T 治疗靶标。有报道发现Cd7 敲除小鼠发育出正常的淋巴器官和免疫反应，并且 Cd7 敲除 T 细胞在体外显示出类似的抗病毒功能，表明 CD7 对于 T 细胞发育和功能来说是可有可无的，目前已经开发出有效的策略来避免 CAR-T 细胞自相残杀。

受试者东部肿瘤合作组（ECOG）状态为0至2级，无移植物抗宿主病或需要免疫抑制剂，5年内无除T-ALL/LBL以外的癌症，或严重肝炎、心脏和全身性疾病，或感染。5年无其他癌症的标准用于区分CAR-T疗法引起的癌症与其他原发癌症的复发。在输注前第5、4和3天进行淋巴细胞清除（氟达拉滨 30 mg/m2/天和环磷酰胺 250 mg/m2/天）。经过6天的输注，患者接受了目标剂量 1×105 /kg 的 CD7 CAR-T 细胞。

该研究的主要终点是评估CD7 CAR-T细胞疗法至少在输注后第28天的安全性。细胞因子释放综合征（CRS）和免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS）根据美国移植和细胞治疗学会系列（ASTCT）共识进行分级。其他不良事件按照不良事件通用术语标准（CTCAE-5.0 版）进行分级。

次要终点是患者中CD7 CAR-T细胞的疗效和生存率以及药代动力学 (PK) 和药效学 (PD) 参数。疗效评估依据2021年NCCN指南。采用流式细胞术（FCM；阈值灵敏度为1×10-4）评估微小残留病（MRD）。

通过PET-CT和/或对比CT和MRI评估髓外疾病(EMD)的反应。CAR-T细胞输注后第28天进行髓外和髓内疾病的评估，此后每3个月进行一次。通过qPCR和FCM（BD Biosciences）测试CD7 CAR-T细胞的增殖和持久性。通过基于细胞微珠阵列 (CBA) 的 FCM（BD Biosciences和BioLegend）检测细胞因子的变化。

二、CAR-T细胞免疫治疗疗效及安全性

对7名R/R T-ALL/LBL患者输注CAR-T细胞后，28天最佳完全缓解(CR)率为100%，中位随访时间为4个月。6例患者出现白细胞减少(leukopenia)、血小板减少(thrombocytopenia)和中性粒细胞减少(neutropenia)症状，5例发生感染。两名患者死于严重感染，一名患者死于脑出血。CAR-T细胞在所有患者中均有高效扩增。输注后第11天外周血中CD7+ T细胞被清除，所有患者体内CD7^- T细胞显著扩增。scRNA-seq分析结果显示，CD7^- T细胞的免疫活性高于输注前的T细胞，这是由于T细胞功能相关途径的表达水平较高，且CD7^- T细胞的主要特征是自身免疫相关途径的激活。2例死于严重感染的患者出现单核细胞丢失，提示CAR-T细胞输注后感染是主要死亡原因。S100A8和S100A9被认为是潜在的复发标志物，相比非复发对照组，它们在复发组的白细胞谱系中显著上调。

安全性方面，不良事件AE中CRS和ICANS发生率分别为85.7%和14.3%。只有1例患者(病例2)有3级CRS和严重的4级ICANS。其他5例患者出现1级CRS，其他所有患者均无ICANS。仅有2例(28.6%)发生移植物抗宿主病(GVHD)。所有患者入组前血细胞指标正常。血液学4级CAR-T细胞相关不良事件包括白细胞减少、血小板减少、中性粒细胞减少6例(85.7%)，其中4级中性粒细胞减少5例(5/6，83.3%)，4级白细胞减少5例(5/5，100%)。6例患者(6/7，85.7%)存在血小板减少，其中4例患者(4/6，66.7%)为4级，其血小板减少持续时间较长，截止时间未得到血小板恢复。

感染发生在5例患者中(71.4%)，病毒激活4例(57.1%)，细菌激活3例(42.9%)。未见真菌感染。病例1在第10至12个月期间患有军团菌肺炎，被认为与使用免疫抑制剂治疗cGVHD有关，与CAR-T治疗无关。病例3反复出现症状性EBV病毒激活和移植后淋巴细胞增殖病(PTLD)，经利妥昔单抗和球蛋白治疗。病例4于第3个月发生肠道艰难梭菌和溶血性葡萄球菌感染，经万古霉素和碳青霉烯类抗生素治疗；于第3.5个月无症状巨细胞病毒(CMV)激活，经钾和磷酸钠治疗。病例5于第3个月发生阴沟肠杆菌合并呼吸道合胞病毒肺炎，于第4个月死于细菌性和病毒性肺炎合并肺出血。病例6在第34天至第40天无症状EBV激活。

三、单细胞转录组测序

1.患者入组

在2020年11月至2021年12月期间7名符合条件的患者入选，随访至2022年5月1日。平均年龄30岁(范围28-38岁)，所有患者在登记前都有allo-HSCT病史。

患者在接受allo-HSCT前接受了中位数为4线(范围：3-8)的化疗。从allo-HSCT到复发的中位持续时间为12个月(5-24个月)。初诊时有5名患者有高危突变或基因融合，命名为MLL Break，涉及SETD2、NOTCH1、BCOR、JAK1、RB1、KIT、KRAS、PHF6和JAK3等基因。入组时，4名患者被诊断为T-LBL，3名患者被诊断为T-ALL，其中BM中原始细胞比例的中位数为94%(范围为0.12%-98.2%)。2例T-ALL和4例T-LBL患者发生EMD，包括弥漫性病变1例，直径>7 cm的纵隔肿块1例，中枢神经系统(CNS)受累3例，高危亚型包括早期T细胞前体(ETP)ALL(42.9%)和原发难治性疾病(71.4%)。中枢神经系统受累患者中，T-ALL 2例，T-LBL 1例。所有患者在输注CAR-T细胞前均接受了至少一线桥接化疗，1患者接受了纵隔淋巴结放疗。

2.样本收集及文库构建

通过对CD7 CAR-T细胞输注前后收集的7个典型病例的外周血单核细胞 (PBMC) 进行单细胞RNA测序(scRNA-seq)分析来评估CART治疗后CD7 T细胞的新增殖以及实际T-ALL/LBL患者经过一系列治疗后其他免疫细胞的功能恢复情况。

scRNA-seq文库是使用Single Cell 3’ Library构建的，使用Illumina Novaseq 6000测序仪对文库进行测序，每个细胞的测序深度至少为20，000个读数，采用双端150 bp (PE150) 读数策略（由iomics执行）。

3.数据分析及软件

测序数据比对和基因表达矩阵计算由cellranger 5.0.1（10x Genomics）进行。参考基因组是通过将人类参考基因组hg38与人类免疫缺陷病毒1(NC_001802.1)相结合而生成的。注释文件版本32(Ensembl 98)与HIV1gp1的注释也结合起来用于鉴定表达基因。从10x Genomics网站下载健康供体PBMCs的单细胞表达矩阵。对于每个单细胞，如果线粒体基因百分比>20%、表达基因数<300或>10，000且通过scds包估计为两个细胞的都进行过滤。

Seurat用于无监督细胞聚类，SCTransform模块用于批量效应校正。为了获得稳健的聚类结果，一共进行了两轮聚类。第一轮，去除线粒体和核糖体基因后，选择3，000 个变异最大的基因，用于整合不同样本的数据并进行主成分(PCA)分析。前30个PC s用于识别分辨率为0.1的细胞簇。UMAP用于可视化聚类结果。SingleR包用于根据细胞类型与celldex包的Monaco免疫数据的相似性来定义细胞类型。注释为粒细胞或来自其所属簇的大多数的不同主要细胞类型的细胞被移除。然后，使用相同的参数(除了分辨率为0.2）进行第二轮聚类。最终的免疫细胞类型通过特定标记基因的表达来注释。

T细胞和CD14+单核细胞以0.4的分辨率进行亚聚类。T细胞亚簇由特定标记基因注释。CAR-T细胞被定义为具有HIV1gp1基因读数的细胞。CD7^- T细胞被定义为没有基因CD7读数的细胞。

每个CD14+单核细胞亚簇被下采样至200个细胞。然后使用cytoTRACE包来估计每个亚簇的发育潜力。根据基因与每个簇的预测发育顺序的相关性对基因进行排序，并通过clusterProfiler对前100个正相关基因和前100个负相关基因进行功能注释。

通过Seurat的“PercentageFeatureSet”函数计算的每个基因集的表达百分比被定义为每个细胞的基因集表达水平。Student t检验用于检验CD7-和CD7+ T细胞在基因集的表达差异显着性。

GSEA由GSEA软件（版本 4.2.3）分析，通路基因集下载MsigDB c2 KEGG基因集。所有样本中含有超过100个细胞的T细胞亚簇均经过GSEA测试，调整后的富集P值<0.01的通路被定义为显着上调/下调。经3次比较显著差异的富集通路热图用pheatmap包展示，根据其重叠基因的通路网络是通过Cytoscape（版本 3.9.1）中ClueGO（版本 2.5.9）内的预选功能（默认参数，边缘加权力导向，CluePedia的 BioLayout）构建的。

GraphPad Prism 9.0 (RRID:SCR_002798) 用于进行数据的统计分析。

四、详细研究结果

1.CAR-T细胞扩增和持久化，以及淋巴细胞亚群重建 CAR-T细胞

第28天，入组时4例无脑转移的T-LBL患者达到CR， 3例有脑转移的T-ALL患者达到MRD阴性CR(图1A)。中位无进展生存期(PFS)和总生存期(OS)分别为4个月和4.6个月(图1B和C)。采用FCM和PCR检测血液中CAR-T细胞扩增情况。CAR-T细胞在第11天至第15天达到峰值，FCM检测的平均计数为51.1个细胞/mL(范围:7.17-497)(图1E)。2例患者(病例2和病例7)在第3个月时无法通过FCM检测到CAR-T细胞，而其他5例患者的CAR-T细胞直到通过PCR检测在血液中进行最终评估时仍可检测到(图1D和E)。但在CAR-T细胞输注3个月后，所有患者体内的 CAR-T细胞拷贝数相对较低（图1F）。在CAR-T细胞反应过程中，大多数患者的血清生物标志物包括IL6、IL10、TNFa、IFNγ和可溶性CD25 (sCD25)轻度升高，这表明CAR-T细胞在输注后被激活(图1G-K)。病例6的T/B/NK/NKT细胞的绝对数量在第21天出现短暂的下降并以低数量恢复，病例6在第3个月因复发而全部增加（图1L）。在CD7 CAR-T输注后的第11天，7例患者外周血中的CD7+ T细胞被消除，然而，所有患者的CD7^- T细胞都急剧扩增(图1M和N)。此外，CD8 + T细胞比例的增加导致CD4+/CD8 +T细胞比例的降低可能是由细胞毒性作用引起的(图10)。

图1.患者治疗相关临床反应

2.CAR T 细胞治疗引起的 T 细胞组成变化

为了进一步分析T-ALL/LBL患者在CD7 CAR-T输注后免疫状态的变化，收集了3例患者(病例4，5和6)在输注前后3周的PBMCs。根据FCM(图2A-C)和PET-CT(图2D)分析，病例4 (T-ALL)和病例5 (T-LBL)分别在输注后达到CR，但不幸的是，病例4个月后因严重感染死亡。病例6 (T-ALL)在输注后达到短期CR，但在第3个月复发(图2E-G)。1例患者(病例1，T-LBL)在CAR-T治疗后12个月达到长期CR，直至复发(图2H)， 1例患者(对照1)在没有CAR-T细胞输注的同种异体造血干细胞移植后无复发症状。

图2.CAR-T细胞输注前后代表性图像

采用来自10x Genomics的健康供体的PBMCs的scRNA-seq数据作为健康对照(对照2)。来自9个样本的61，757个细胞共分为11个细胞群，包括4个骨髓细胞亚群、5个T细胞亚群、1个NK细胞亚群和1个B细胞亚群(图3A和B)。CAR-T治疗后短时间的PBMCs样本显示MKI67+ T细胞比例显著增加(图3C)，表明在CD7 CAR-T清除恶性和正常T细胞后，T细胞增殖被激活。此外，我们还观察到CD16+ T细胞显著增加（图3C)，有报道称其与过度的细胞毒性功能有关，并与COVID-19感染期间的严重炎症有关，这一现象可以解释CD7 CAR-T治疗后持续近2周的系统炎症。

为了进一步评估治疗前后T细胞组成的变化，我们以更高的分辨率重新聚集T细胞，并确定了14个亚簇(图3D)。表达慢病毒载体mRNA的CAR-T细胞残留的比例从第3周的27.1%下降到第10个月的0.2%。CAR-T残留的主要亚型属于GZMK+记忆T细胞(11.9%-35.8%)和CD16+ a/β T细胞(23.8%-32.9%)，这表明CAR-T细胞的记忆和细胞毒功能增强。治疗前本体CD7^- T细胞占总T细胞的34% ~ 52%，治疗后CD7^- T细胞显著扩增，10个月时占比达到99.8%，与FCM结果一致(图1M和N)。通过比较处理后样本中，本体CD7+ T细胞与GZMK+ T和CD16+ a/β CAR-T细胞比例，我们发现两者呈显著负相关(图3F)，这表明了这些CAR-T细胞的T细胞消除功能。在具有最高CD7+ T细胞占比的样本中观察最高的幼稚CD8+ T细胞，进一步表明该患者正在进行T细胞清除过程。

治疗后GZMH+ T细胞成为最丰富的细胞类型(20.4%-48.7%)，仅占对照2中T细胞的7%(图3E)。据报道，这些细胞表现出明显的克隆性增殖，并在狼疮患者中发挥致病作用。3例患者治疗后CD4+ 幼稚T细胞均下降3倍(图3E)，这些观察表明，CD7 CAR-T治疗后的免疫重建过程可能与以淋巴细胞减少和“表位扩散”为特征的自身免疫反应有相似之处。

图3.CAR-T细胞治疗后T细胞组成发生变化

3.CD7^-T细胞免疫功能评价

比较4种主要T细胞亚型GZKH+、GZMK+、幼稚CD4+和幼稚CD8+T细胞，在输注前后T细胞受体（TCR）、T细胞激活途径和TCR信号通路相关基因集的表达水平变化。结果发现，几乎在所有T细胞亚型中，除了病例5的幼稚CD4+ T细胞中的T细胞活化途径(图4A)外，这三个基因集在处理后的样品中表现出相同或更高的表达水平。

另外，采用GSEA方法在传统通路基因集水平上探讨预处理样品中CD7-和CD7+细胞的功能差异。CD7^- T细胞在CD7 CAR-T治疗前的T-ALL /LBL患者或健康供体中显示出与CD7+ T细胞相似的功能，因为不同样本之间只有有限的富集通路共享。

进一步构建通路网络，探索丰富通路之间的隐藏关系（图4B）。富集结果中T细胞功能和免疫系统相关途径的缺失进一步支持CD7对T细胞功能没有关键作用。CD7^- T细胞在治疗后表现出明显的狼疮相关功能的激活（图4C），这与上述T细胞的组成变化是一致的，这些路径形成了网络中最大的模块(图4B)。有趣的是，病例1在输注非复发对照(对照1)和健康外周血单核细胞(对照2)后10个月采集的样本之间的比较也发现了自身免疫相关功能的激活(图4B)。除上述狼疮相关通路被激活外，病例1还表现出MTOR和ERBB信号相关网络模块的抑制（图4B）。MTOR信号通路抑制CD8+记忆T细胞的分化和功能。在病例1中，这种抑制可能导致T细胞功能激活。

图4.CD7+ T细胞与CD7^- T细胞功能差异

通过对治疗前后样本以及CD7-和CD7+ T细胞之间四种主要细胞因子(IL6、IL10、TNF和INFG)的表达水平比较分析，发现在大多数T细胞亚型中没有明显的细胞因子表达差异。此外，在CMV肽刺激24小时后，病例7收集的PBMCs中多种促炎因子(IFNγ、G-CSF、GM-CSF、IL1a、IL1b、MIF和TNFa)的水平显著高于体外对照组。这些结果表明，经过CD7^- CAR-T治疗后重建的CD7 T细胞群具有正常的免疫功能。

4.免疫细胞谱与感染之间的关联

CD7 CAR-T细胞输注后感染是一种严重的不良事件（AEs），在其他研究中也发生过。如图4C所示，病例5在治疗后因严重感染死亡，其T细胞表现出明显的细胞因子功能抑制；相比之下，没有感染症状的病例6在治疗后趋化因子信号传导增强。此外，病例4和病例5单核细胞数量大幅减少(图5A)，说明这些患者的严重感染是由于单核细胞重构失败引起的。

为了进一步解释单核细胞缺失对CD7 CAR-T细胞治疗的影响，单独拿出CD14+单核细胞进行了亚聚类分析后分为8个亚簇，其中簇4在病例6输注前比例最高，治疗后无感染，单核细胞无改变(图5B和C)。cytoTRACE预测该簇分化程度最低(图5D)。与发育潜能呈正相关的基因在抗原加工功能方面过度表达，相反，负相关的基因在白细胞分化和激活功能中富集(图5E和F)。发育潜能与AP-1 (JUN或FOSB；图5E)负相关，它是单核细胞向巨噬细胞分化过程中的一个关键转录因子，进一步支持了簇4的低分化状态。这些数据提示，预处理样品中缺乏高发育潜力的单核细胞可能导致CD7 CAR-T治疗后单核细胞重建受损，从而导致感染性AE。

图5.免疫细胞谱与感染之间的关联

5.T细胞表达谱与T-ALL/LBL复发的关联

通过比较单个T细胞的表达谱，以揭示CD7 CAR-T细胞输注前后T- ALL /LBL患者中可能与复发相关的基因特征。研究发现，S100A8、S100A9和LYZ都被认为是潜在的广泛复发标志物，无论采取何种治疗策略，它们在每种T细胞亚型的复发样本中都有显著上调(图6A)。S100A8和S100A9以异源二聚体形式编码钙保护蛋白，在健康状况下主要在髓细胞中表达，在淋巴细胞中不表达。特别是，这两个基因在复发性ALL中表达上调程度最高。在病例4、5、6的CD7前CAR-T治疗样本中，S100A8和S100A9的表达水平显著高于未复发对照1和健康对照2 (Wilcox-rank检验；图6A)。S100A8和S100A9的表达在病例4和病例5的CD7 CAR-T治疗后的样本中达到最低水平，没有复发症状。相比之下，S100A8和S100A9在病例6处理后的PBMCs中表达最高(图6A)。在B细胞和NK细胞中也观察到类似的这三个基因的表达谱，表明S100A8、S100A9和LYZ基因的上调可能始于淋巴样祖细胞（图6B）。

图6.T-ALL复发标志物表达谱

五、总结

本文启动了一项开放标签的I期临床试验，以评估供体来源的CD7嵌合抗原受体T (CAR-T)细胞治疗复发或难治性T细胞急性淋巴细胞白血病/淋巴瘤(R/R T-ALL/LBL)患者的安全性和有效性。所有患者在CD7 CAR-T细胞输注后第28天达到完全缓解(CR)，随后出现感染、复发或某些患者死亡。通过单细胞RNA测序(scRNA-seq)分析CAR-T治疗后的免疫重建，结果表明重建的CD7^- T细胞具有与输注前患者或健康供者的T细胞相当的免疫功能，预防输注后感染的主要挑战可能是防止单核细胞丢失。此外，白细胞谱系中S100A8和S100A9的上调可能被认为是潜在的复发标志物。该研究结果为更好地利用CD7 CAR-T疗法治疗R/R T-ALL/LBL提供了合理的策略优化依据。

来源：生信人

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