BioNTech独特mRNA纳米颗粒表征方式，解析多种纳米药物关键质量属性

撰文：Vergil

编辑：RNAScript

纳米级药物颗粒，包括基于脂质、聚合物、多肽、蛋白质的有机材料以及如金属、金属氧化物、二氧化硅等的无机材料。受限于无菌过滤极限（≤0.45μm），这些纳米颗粒的粒径通常低于200nm。

所有这些纳米级药物的特性都以其胶体性质为主，其中粒径和尺寸相关属性对质量控制、生物功效和产品安全性至关重要。大多数纳米颗粒药物体系，包括脂质体和基于脂质或聚合物的纳米颗粒，都具有一定程度的本征多分散性，需要获取有关粒度分布曲线和粒度相关参数的信息用于识别关键质量属性（CQA）和关键工艺参数（CPP）。据悉，目前还没有方法可以原位测定100nm及以下尺寸范围内胶体颗粒的绝对尺寸分布曲线。

来自BioNTech和美因茨约翰内斯·古腾堡大学的研究团队在scientific reports上发表了题为“Quantitative size-resolved characterization of mRNA nanoparticles by in-line coupling of asymmetrical-flow field-flow fractionation with small angle X-ray scattering”的研究成果。团队提出了一种通用的纳米颗粒表征方法，以确定纳米颗粒药物的尺寸依赖性关键质量属性。

通过将非对称流场流分离（AF4）测量技术直接与溶液小角X射线散射（SAXS）装置耦合，可以获得多项质量相关的重要信息：（i）定量/绝对尺寸分布曲线；（ii）药物负载；（iii）尺寸依赖性内部结构；（iv）游离药物的定量信息等。

本研究通过表征模型蛋白和基于mRNA的脂质纳米颗粒产物证明了该方法的有效性。此外，经验证，该方法还适用于尺寸范围为100 nm及以下的多种生物制剂和纳米颗粒药物，也可以应用于包括结构生物学和环境科学的其他科研领域。

AF4 与溶液SAXS

非对称流场流分离技术（AF4）

非对称流场流分离技术的基本原理是通过改变流体的流动状态，使其在流动过程中产生非对称的流场，从而实现流体的分离和控制。简单而言，不同成分在场的作用下距下壁的位置不同，因此有不一样的移动速度，从而达到将大分子、胶体和微粒分离的目的。这种技术可以通过改变流体的速度、压力、温度等参数来实现，同时还可以通过改变流体的流动方向、流动路径等来实现，能够在大约1-1000 nm的范围内分离颗粒。

小角X射线散射（SAXS）

小角X射线散射（Small Angle X-ray Scattering，SAXS）是研究纳米尺度结构的一种常用方法，在高分子、凝胶、金属等领域有着广泛的应用。由于这些分子维持正常的功能需要溶液环境，所以开展此类实验的装置也叫溶液SAXS装置。

当X射线照射到试样上，在靠近入射X光束周围2°~5°的小角度范围内发生的散射现象。由于电磁波的散射遵循反比定律——被照物体的有效尺寸相对于入射波越大，电磁波的散射角越小，因此SAXS可提供尺寸范围从数百纳米到亚Ångstrom尺度的直接结构信息。

AF4 + SAXS

尺寸分散方法（SEC）与SAXS的组合已成功应用于结构生物学领域。通过将SEC直接连接到SAXS测量池的方法通常被称为SEC-SAXS。但SEC并不适用于所有系统，局限性包括与固定相相互作用产生不希望的剪切力，以及对于更广泛分散的样品的分辨率受限。

与此相反，AF4允许改变多个仪器参数，有助于为给定类型的样品或产品开发量身定制的表征方法。此外，AF4允许在更大的尺寸范围和多分散水平上进行分离，更适用于剪切力敏感样品。

图1. AF4耦合SAXS的流程与设备

AF4-SAXS仪器放置在P12光束线的实验舱中。如图1B所示，带有分馏通道（左）的 AF4 设置在线连接到P12 SAXS 流通池（右）。样品分离和数据收集从控制舱远程启动。进样后，样品中的颗粒在AF4通道中按大小分馏。紫外-可见光和多角度光散射（MALS）检测器放置在流通式SAXS毛细管P12（PETRAIII）之前进行表征。

蛋白质和mRNA-LPX的表征验证

牛血清白蛋白（BSA）

聚集状态的控制对于蛋白质等生物制剂的质量控制至关重要。了解蛋白质错误折叠以及聚集化过程对于优化工艺设计和配方开发至关重要。

模型蛋白BSA是研究球状蛋白聚集机制的优秀模型，在各种实验条件下形成低聚态。本研究使用模型蛋白BSA进行设置和系统验证。从AF4偶联SAXS或SEC偶联SAXS中以40 mg/mL的速度在PBS中进样5μL BSA后收集SAXS数据。

AF4装置成功分离BSA后，使用UV280，MALS，SAXS检测获得的洗脱曲线较为一致（图2A）。通过与未分离样品收集的样品比较（图2B），AF4成功从样品中分离了较大的物质。低q散射和回转半径Rg的减小，最大距离Dmax以及分子量（MW）均与单体BSA的散射一致，并未含有低聚级分的混合物。主洗脱峰和第二峰的恒定MW分布进一步证实了BSA成功分离成单分散馏分。

SEC和AF4均能正确将单体和低聚物分离。但AF4首先洗脱较小尺寸的颗粒，而SEC则相反（图2C）。尽管两种方式在数据收集时间、样品消耗和数据质量方面相当，但AF4优先洗脱小颗粒的特性突出了AF4在低聚物分离时的优势且能在更大的尺寸范围上和多分散水平上进行分离。

图2. 模型蛋白BSA的系统验证

mRNA-LPX 

为更直观体现AF4-SAXS系统的表征优势，研究团队特别选用了包封过量mRNA形成的LPX系统，使样品中带负电荷的多分散LPX纳米颗粒与一部分游离的mRNA共存。 

图3B表示LPX配方与洗脱时间的AF4-SAXS分析，叠加源自UV、LS和SAXS的分形图，包括Rg值。可以显著观察到第一个峰（约18 min）来自游离mRNA，第二个峰（约40 min）来自mRNA-LPX复合纳米颗粒，表明AF4方法用于分析当前样品中的LPX纳米颗粒的有效性。

图3. LPX分馏样品的AF4耦合SAXS分析

通过对比LPX-mRNA与BSA的SAXS距离分布函数p（r）和Kratky plot（图4），可以发现mRNA与BSA的结构具有很大不同。mRNA的曲线表明非结构化的无规则弧线构象，而BSA呈球状堆积，突出了SAXS在提供纳米颗粒构效信息方面的优势和灵活性。

图4.mRNA分级分离的散射曲线

总结

本研究通过将SAXS与经典的多探测器AF4耦合以及对来自不同探测器的数据进行联合分析来实现纳米颗粒的定量、绝对尺寸分布曲线。依靠该分析方法可以获得有价值的产品信息：产品特性，例如以μg/mL为单位的LPX浓度，颗粒数，mRNA拷贝数和每个颗粒负载的mRNA拷贝数等，使得AF4-SAXS可用于揭示复杂、广泛分散系统的定量特征。此外，该方法还能够解析不同纳米颗粒的结构、形状以及不同馏分的信息，可有效满足质量控制和安全性评估的要求，有望成为有力的纳米颗粒表征工具。

参考资料

Graewert, M.A., Wilhelmy, C., Bacic, T. et al. Quantitative size-resolved characterization of mRNA nanoparticles by in-line coupling of asymmetrical-flow field-flow fractionation with small angle X-ray scattering. Sci Rep 13, 15764 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-42274-z

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